膿素癥內(nèi)皮細(xì)胞凝血功能障礙與p38MAPK-NF-κB傳導(dǎo)通路的關(guān)系及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、前言
　　膿毒癥是嚴(yán)重全身感染引起的炎癥反應(yīng)過(guò)度激活及凝血機(jī)能障礙。而內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcell，EC)是凝血啟動(dòng)和炎癥反應(yīng)激活過(guò)程中最重要的效應(yīng)細(xì)胞，因此，EC活化和功能障礙是膿毒癥發(fā)展惡化的中心環(huán)節(jié)。
　　組織因子(TF)是外源性凝血途徑的啟動(dòng)因子，單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞能表達(dá)TF。正常情況下，TF在直接接觸血液的EC中表達(dá)量很低，在多種致炎刺激時(shí)，EC表達(dá)TF顯著增加，從而可能在膿毒

2、癥情況下，啟動(dòng)TF介導(dǎo)的凝血激活。血管性假性血友病因子(vonWillebrandfactor，vWF)由血管內(nèi)皮細(xì)胞或巨核細(xì)胞合成。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，可致vWF等內(nèi)容物釋放入血增多，因此vWF是反映內(nèi)皮細(xì)胞受損的重要標(biāo)記物，其水平高低可反映血管內(nèi)皮受損嚴(yán)重程度，并可作為治療、判定預(yù)后的一項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)。在膿毒癥時(shí)腫瘤壞死因子(TNF-α)分泌顯著地增多，被認(rèn)為是介導(dǎo)感染性休克損傷的首要介質(zhì)，起著扳機(jī)樣關(guān)鍵作用。
　　在炎癥介質(zhì)表

3、達(dá)調(diào)控中，核因子-κB(NF-κB)激活和核移位是關(guān)鍵的一步。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogenactivatedproteinkinaseMAPK)是MAPK家族成員之一，在腫瘤的發(fā)生、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥、缺血再灌注損傷及免疫調(diào)控等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是凝血與炎癥相互影響的病理生理基礎(chǔ)。已有研究證實(shí)通過(guò)p38MAPK/NF-κB通路可使膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞進(jìn)入炎癥表型。探討對(duì)凝血和炎性反應(yīng)都具有重要意義的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)

4、制，可能面臨廣闊的應(yīng)用前景，成為一條新的治療膿毒癥的途徑。
　　凋亡是膿毒癥的中心特征。細(xì)胞凋亡的調(diào)控是一種復(fù)雜的多水平的調(diào)控，多種因素相互作用促進(jìn)或抑制凋亡的發(fā)生。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)都表明在內(nèi)毒素所致的心肌損傷和肝損傷等臟器損傷中凋亡顯著增加。p38MAPK和NF-κB與凋亡關(guān)系密切。肝素是實(shí)用性最強(qiáng)、最便宜、最常用的抗凝藥物。除具有抗凝、抗血栓形成的作用外，還具有多種效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1、ELISA方法檢測(cè)膿毒癥病人

5、和健康對(duì)照者血中的TF、vWF和TNF-α
　　應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)。每個(gè)標(biāo)本做三孔檢測(cè)。
　　2、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)與傳代
　　臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)接種于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.125％胰蛋白酶（含0.01％EDTA）消化。
　　3、實(shí)驗(yàn)分組
　　分為陰性對(duì)照組:正常人血漿;陽(yáng)性對(duì)照組:TNF-α20ng/ml;實(shí)驗(yàn)組:不同濃度的膿毒癥病人血漿;拮

6、抗劑組:SB239063（p38MAPK的拮抗劑），PDTC(NF-κB的拮抗劑)，U0126（ERK1/2的拮抗劑）+膿毒癥病人血漿;肝素組:不同濃度的肝素。
　　4、檢測(cè)膿毒癥血漿刺激HUVEC上清液中TF、vWF的表達(dá)
　　將制成的細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105/ml，種植于24孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48小時(shí)后，細(xì)胞已貼壁融合。換用無(wú)酚紅無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞同步于G0期。按陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組

7、和拮抗劑組加入不同的刺激因素。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)。每個(gè)標(biāo)本做三孔檢測(cè)。
　　5、Westernblot法檢測(cè)MAPK亞基及NF-κB蛋白表達(dá)的變化
　　提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，測(cè)量待測(cè)樣本A650值，蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫印跡法，蛋白印跡的分析。
　　6、免疫熒光方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中p38MAPK和NF-κB的表達(dá)
　　將細(xì)胞懸液滴在鋪有凝膠的蓋玻片上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-36h。加入不同的刺激因素，并經(jīng)過(guò)

8、固定，打孔，封閉，加入一抗，二抗等步驟，最后在熒光顯微鏡下觀察。
　　7、HUVEC凋亡的檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)組加入10％膿毒癥血漿;拮抗劑組加入SB23906325μM，PDTC200μM作用1h后，再加入10％膿毒癥血漿;肝素組加入肝素20U/ml作用1h后，再加入10％膿毒癥血漿;作用3h，6h，12h，18h。用0.125％胰蛋白酶（不含EDTA）消化HUVEC，制成細(xì)胞懸液。應(yīng)用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑

9、盒，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　一、膿毒癥病人TF，vWF和TNF-α的檢測(cè)結(jié)果
　　1、TF，vWF和TNF-α在膿毒癥病人和正常人血中的含量
　　分別檢測(cè)凝血活性指標(biāo)TF，內(nèi)皮損傷指標(biāo)vWF以及炎癥介質(zhì)TNF-α，結(jié)果顯示膿毒癥病人組明顯高于正常人組(P=0.00)。
　　2、TF，vWF和TNF-α在膿毒癥死亡病人和存活病人間的比較
　　分別比較了16名存活病人和8名死亡病人的TF，

10、vWF和TNF-α，發(fā)現(xiàn)TF，TNF-α在兩組病人中的差別有顯著性，vWF在兩組病人間無(wú)差別。
　　3、不同APACHEⅡ評(píng)分的膿毒癥病人中TF，vWF和TNF-α
　　16分以上病人的TF和TNF-α值與8-10分相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。APACHEⅡ評(píng)分較高病人（21分以上）的vWF與8-10分相比才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、膿毒癥病人中TF，vWF和TNF-α之間的相關(guān)性
　　TF和TNF-α之間有明顯的相關(guān)性(

11、r=0.696，p＜0.01)，TF和vWF之間，vWF和TNF-α之間有較弱的相關(guān)性（r=0.531，p＜0.05和r=0.442，p＜0.05）。
　　二、膿毒癥病人血漿對(duì)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞TF、vWF產(chǎn)生和p38MAPK、NF-kB途徑的影響
　　1、膿毒癥血漿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TF、vWF產(chǎn)生的影響
　　vWF在120min達(dá)到高峰，隨之下降;TF在180min最高。10％、20％、30％膿毒癥病人血漿刺激HUVEC均可引起

12、vWF和TF的升高。在一定范圍和時(shí)間內(nèi)，vWF和TF的升高與sepsis血漿呈時(shí)間，劑量依賴關(guān)系。
　　2、檢測(cè)膿毒癥血漿刺激HUVEC后p-p38，p-ERK1/2的表達(dá)
　　Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明磷酸化p38，磷酸化ERK1/2在各時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的表達(dá)，30min的磷酸化p38表達(dá)最明顯。
　　3、膿毒癥血漿刺激后，HUVECp38，NF-kB的表達(dá)
　　用ELISA方法和免疫熒光兩種方法進(jìn)行

13、檢測(cè)。證實(shí)p38，NF-kB參與膿毒癥的內(nèi)皮損傷和凝血功能障礙。
　　4、p38MAPK對(duì)HUVECNF-κB活化的影響
　　用20％膿毒癥血漿刺激HUVEC，可以看到2minp38開始活化，5minNF-κB活化，加入p38拮抗劑SB239063后，NF-κB活化受阻。
　　三、膿毒癥血漿和肝素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響
　　1、膿毒癥血漿作用6h對(duì)HUVEC凋亡的影響
　　膿毒癥血漿作用6h未引起HUVEC凋

14、亡的增加。
　　2、不同因素作用12h對(duì)HUVEC凋亡的影響
　　10％膿毒癥血漿作用12h可引起細(xì)胞凋亡增加。p38MAPK和肝素促進(jìn)細(xì)胞凋亡，NF-κB抑制細(xì)胞凋亡。
　　3、不同因素作用18h對(duì)HUVEC凋亡的影響
　　10％膿毒癥血漿作用18h可引起細(xì)胞凋亡增加，程度大于12h。p38MAPK和肝素促進(jìn)細(xì)胞凋亡，NF-κB抑制細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論
　　1、膿毒癥病人血中TF，vWF和TNF-α