膿素癥內(nèi)皮細胞凝血功能障礙與p38MAPK-NF-κB傳導通路的關(guān)系及其作用機制的研究.pdf

1、前言
　　膿毒癥是嚴重全身感染引起的炎癥反應(yīng)過度激活及凝血機能障礙。而內(nèi)皮細胞(endothelialcell，EC)是凝血啟動和炎癥反應(yīng)激活過程中最重要的效應(yīng)細胞，因此，EC活化和功能障礙是膿毒癥發(fā)展惡化的中心環(huán)節(jié)。
　　組織因子(TF)是外源性凝血途徑的啟動因子，單核細胞、平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞等多種炎性細胞能表達TF。正常情況下，TF在直接接觸血液的EC中表達量很低，在多種致炎刺激時，EC表達TF顯著增加，從而可能在膿毒

2、癥情況下，啟動TF介導的凝血激活。血管性假性血友病因子(vonWillebrandfactor，vWF)由血管內(nèi)皮細胞或巨核細胞合成。當血管內(nèi)皮細胞受損時，可致vWF等內(nèi)容物釋放入血增多，因此vWF是反映內(nèi)皮細胞受損的重要標記物，其水平高低可反映血管內(nèi)皮受損嚴重程度，并可作為治療、判定預(yù)后的一項評價指標。在膿毒癥時腫瘤壞死因子(TNF-α)分泌顯著地增多，被認為是介導感染性休克損傷的首要介質(zhì)，起著扳機樣關(guān)鍵作用。
　　在炎癥介質(zhì)表

3、達調(diào)控中，核因子-κB(NF-κB)激活和核移位是關(guān)鍵的一步。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogenactivatedproteinkinaseMAPK)是MAPK家族成員之一，在腫瘤的發(fā)生、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥、缺血再灌注損傷及免疫調(diào)控等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。信號轉(zhuǎn)導通路是凝血與炎癥相互影響的病理生理基礎(chǔ)。已有研究證實通過p38MAPK/NF-κB通路可使膿毒癥誘導的心肌細胞進入炎癥表型。探討對凝血和炎性反應(yīng)都具有重要意義的信號轉(zhuǎn)導機

4、制，可能面臨廣闊的應(yīng)用前景，成為一條新的治療膿毒癥的途徑。
　　凋亡是膿毒癥的中心特征。細胞凋亡的調(diào)控是一種復雜的多水平的調(diào)控，多種因素相互作用促進或抑制凋亡的發(fā)生。多項實驗都表明在內(nèi)毒素所致的心肌損傷和肝損傷等臟器損傷中凋亡顯著增加。p38MAPK和NF-κB與凋亡關(guān)系密切。肝素是實用性最強、最便宜、最常用的抗凝藥物。除具有抗凝、抗血栓形成的作用外，還具有多種效應(yīng)。
　　實驗方法
　　1、ELISA方法檢測膿毒癥病人

5、和健康對照者血中的TF、vWF和TNF-α
　　應(yīng)用ELISA試劑盒檢測。每個標本做三孔檢測。
　　2、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)與傳代
　　臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)接種于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.125％胰蛋白酶（含0.01％EDTA）消化。
　　3、實驗分組
　　分為陰性對照組:正常人血漿;陽性對照組:TNF-α20ng/ml;實驗組:不同濃度的膿毒癥病人血漿;拮

6、抗劑組:SB239063（p38MAPK的拮抗劑），PDTC(NF-κB的拮抗劑)，U0126（ERK1/2的拮抗劑）+膿毒癥病人血漿;肝素組:不同濃度的肝素。
　　4、檢測膿毒癥血漿刺激HUVEC上清液中TF、vWF的表達
　　將制成的細胞懸液調(diào)整細胞數(shù)為5×105/ml，種植于24孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48小時后，細胞已貼壁融合。換用無酚紅無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，使細胞同步于G0期。按陰性對照組，實驗組

7、和拮抗劑組加入不同的刺激因素。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測。每個標本做三孔檢測。
　　5、Westernblot法檢測MAPK亞基及NF-κB蛋白表達的變化
　　提取細胞蛋白質(zhì)，測量待測樣本A650值，蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫印跡法，蛋白印跡的分析。
　　6、免疫熒光方法檢測內(nèi)皮細胞中p38MAPK和NF-κB的表達
　　將細胞懸液滴在鋪有凝膠的蓋玻片上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-36h。加入不同的刺激因素，并經(jīng)過

8、固定，打孔，封閉，加入一抗，二抗等步驟，最后在熒光顯微鏡下觀察。
　　7、HUVEC凋亡的檢測
　　實驗組加入10％膿毒癥血漿;拮抗劑組加入SB23906325μM，PDTC200μM作用1h后，再加入10％膿毒癥血漿;肝素組加入肝素20U/ml作用1h后，再加入10％膿毒癥血漿;作用3h，6h，12h，18h。用0.125％胰蛋白酶（不含EDTA）消化HUVEC，制成細胞懸液。應(yīng)用AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑

9、盒，在流式細胞儀上檢測。
　　實驗結(jié)果
　　一、膿毒癥病人TF，vWF和TNF-α的檢測結(jié)果
　　1、TF，vWF和TNF-α在膿毒癥病人和正常人血中的含量
　　分別檢測凝血活性指標TF，內(nèi)皮損傷指標vWF以及炎癥介質(zhì)TNF-α，結(jié)果顯示膿毒癥病人組明顯高于正常人組(P=0.00)。
　　2、TF，vWF和TNF-α在膿毒癥死亡病人和存活病人間的比較
　　分別比較了16名存活病人和8名死亡病人的TF，

10、vWF和TNF-α，發(fā)現(xiàn)TF，TNF-α在兩組病人中的差別有顯著性，vWF在兩組病人間無差別。
　　3、不同APACHEⅡ評分的膿毒癥病人中TF，vWF和TNF-α
　　16分以上病人的TF和TNF-α值與8-10分相比均有統(tǒng)計學意義。APACHEⅡ評分較高病人（21分以上）的vWF與8-10分相比才有統(tǒng)計學意義。
　　4、膿毒癥病人中TF，vWF和TNF-α之間的相關(guān)性
　　TF和TNF-α之間有明顯的相關(guān)性(

11、r=0.696，p＜0.01)，TF和vWF之間，vWF和TNF-α之間有較弱的相關(guān)性（r=0.531，p＜0.05和r=0.442，p＜0.05）。
　　二、膿毒癥病人血漿對培養(yǎng)內(nèi)皮細胞TF、vWF產(chǎn)生和p38MAPK、NF-kB途徑的影響
　　1、膿毒癥血漿對內(nèi)皮細胞TF、vWF產(chǎn)生的影響
　　vWF在120min達到高峰，隨之下降;TF在180min最高。10％、20％、30％膿毒癥病人血漿刺激HUVEC均可引起

12、vWF和TF的升高。在一定范圍和時間內(nèi)，vWF和TF的升高與sepsis血漿呈時間，劑量依賴關(guān)系。
　　2、檢測膿毒癥血漿刺激HUVEC后p-p38，p-ERK1/2的表達
　　Westernblot檢測結(jié)果表明磷酸化p38，磷酸化ERK1/2在各時間點均有不同程度的表達，30min的磷酸化p38表達最明顯。
　　3、膿毒癥血漿刺激后，HUVECp38，NF-kB的表達
　　用ELISA方法和免疫熒光兩種方法進行

13、檢測。證實p38，NF-kB參與膿毒癥的內(nèi)皮損傷和凝血功能障礙。
　　4、p38MAPK對HUVECNF-κB活化的影響
　　用20％膿毒癥血漿刺激HUVEC，可以看到2minp38開始活化，5minNF-κB活化，加入p38拮抗劑SB239063后，NF-κB活化受阻。
　　三、膿毒癥血漿和肝素對內(nèi)皮細胞凋亡的影響
　　1、膿毒癥血漿作用6h對HUVEC凋亡的影響
　　膿毒癥血漿作用6h未引起HUVEC凋

14、亡的增加。
　　2、不同因素作用12h對HUVEC凋亡的影響
　　10％膿毒癥血漿作用12h可引起細胞凋亡增加。p38MAPK和肝素促進細胞凋亡，NF-κB抑制細胞凋亡。
　　3、不同因素作用18h對HUVEC凋亡的影響
　　10％膿毒癥血漿作用18h可引起細胞凋亡增加，程度大于12h。p38MAPK和肝素促進細胞凋亡，NF-κB抑制細胞凋亡。
　　結(jié)論
　　1、膿毒癥病人血中TF，vWF和TNF-α