糖尿病大鼠早期內(nèi)皮功能障礙與oxLDL-LOX-1和NF-κB信號通路的關(guān)系及其干預(yù)研究.pdf

1、研究背景和目的： 本研究以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型，在造模成功后即給予牛磺酸干預(yù)，并同胰島素治療做比較，通過在體直接檢測糖尿病大鼠早期血管內(nèi)皮的超微結(jié)構(gòu)改變和功能狀態(tài)改變，同時從分子生物學水平檢測循環(huán)中或主動脈血管內(nèi)皮oxLDL、LOX-1、NF-κBp65及ICAM-1的表達水平，初步探討oxLDL/LOX-01系統(tǒng)及NF-κB信號通路在糖尿病早期血管內(nèi)皮功能障礙中的作用，以及?；撬釋μ悄虿⊙軆?nèi)皮的保護作用與可能機制

2、。 研究方法： 1.實驗?zāi)Ｐ偷慕⒓胺纸M：選用8周齡SPF級雄性wistar大鼠65只，體重180～200g，隨機取出16只作為正常對照組，其余給予一次性腹腔注射STZ60mg/kg誘導(dǎo)1型糖尿病模型，注射STZ72h后尾靜脈取血檢測血糖≥16.7mmol/L、尿糖+++以上者表示造模成功。 2.檢測指標及方法 ①體重和血糖：每周測量一次體重和空腹血糖，血糖采用One TouchⅡ血糖儀檢測。 ②

3、外周血指標的檢測：外周血甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平采用全自動生化分析儀檢測；血清可溶性ICAM-1、oxLDL水平采用Elisa方法檢測；血清NO水平采用硝酸還原酶比色法檢測；血漿內(nèi)皮素含量采用放射免疫法檢測。 ③離體胸主脈環(huán)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)：大鼠處死取血后，立即游離胸主動脈，剪取最上段約3～5mm主動脈環(huán)檢測不同濃度乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)，計算并繪制log Ach濃度依賴的血管舒張曲

4、線，Rmax代表Ach誘導(dǎo)的血管環(huán)舒張最大百分比，直線回歸方程計算EC50。 ④血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)觀察：胸主動脈組織依次經(jīng)戊二醛、鋨酸固定、脫水、包埋，甲苯胺蘭超薄切片后行透射電鏡鈾--鉛雙重染色，觀察主動脈血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 ⑤主動脈壁LOX-1、NF-κBp65、ICAM-1蛋白的組織表達：冰凍切片免疫熒光染色法定性檢測胸主動脈血管壁LOX-1蛋白的表達；石蠟切片免疫組化SP法檢測胸主動脈血管壁NF-κBp6

5、5、ICAM-1蛋白的表達。 ⑥Western blot方法定量分析LOX-1、NF-κ Bp65在主動脈壁的蛋白含量：提取主動脈組織標本的蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，先后加入稀釋的LOX-1、NF-κ Bp65--抗及辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育，經(jīng)ECL顯影、凝膠成像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶進行光密度分析。以β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白/β-actin蛋白條帶吸光度值作為蛋白表達強度。 ⑦逆轉(zhuǎn)錄--

6、聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測LOX-1、NF-κ Bp65、ICAM-1 mRNA在主動脈血管壁的表達水平：提取各組主動脈總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、成像分析。分別以LOX-1，NF-κBp65，ICAM-1與β-actin擴增條帶吸光度比值作為其mRNA表達強度。 3.統(tǒng)計分析：采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包，統(tǒng)計資料用x±s描述，組間數(shù)據(jù)分析之前先進行方差齊性檢驗，方差齊性指標進行

7、單因素方差分析及兩兩比較Q檢驗，方差不齊的指標進行獨立樣本秩和檢驗及兩兩比較；部分變量間相關(guān)性分析采用Person相關(guān)性分析與Partial相關(guān)分析。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。 研究結(jié)果： 1.一般情況及體重、血糖的變化：與正常對照組比較，所有糖尿病大鼠血糖明顯升高，并一直維持于高水平狀態(tài)，且體重增長緩慢，明顯低于正常對照組大鼠；胰島素治療組大鼠血糖控制理想，體重增長理想，同正常對照組比較差異不明顯；?；撬岣深A(yù)對

8、糖尿病大鼠體重、血糖無明顯改善。 2.血脂水平的變化：同正常對照組比較，糖尿病組大鼠2周時血脂變化不明顯，6周時出現(xiàn)血TC、TG、LDL的明顯升高；胰島素治療組血脂指標明顯改善，TC、TG、LDL降至正常水平，牛磺酸干預(yù)組大鼠TC、TG水平明顯下降，但與正常對照組比較仍有差異. 3.外周血oxLDL、NO、ET及sICAM-1水平的變化：糖尿病組2周時，大鼠血清oxLDL、NO和血漿ET水平出現(xiàn)升高，6周時血清oxLDL

9、、sICAM-1及血漿ET水平明顯升高，同時伴隨著血清NO水平及NO/ET值的明顯降低，同正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義；同糖尿病組比較，胰島素治療組和牛磺酸干預(yù)組血清oxLDL水平明顯降低，但與正常對照組比較仍有差異。 4.胸主動脈血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化：正常大鼠主動脈內(nèi)膜表面平整，內(nèi)皮細胞扁平狀，排列規(guī)則，細胞器形態(tài)數(shù)量正常，胞核規(guī)則；糖尿病2周時，內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)變化不明顯，6周時內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)變化明顯，出現(xiàn)內(nèi)皮細胞腫脹、

10、部分脫落，基底板部分斷裂，內(nèi)皮細胞微絨毛消失、線粒體嵴突模糊，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、核周池擴張、核皺縮變形等改變。 5.離體血管Ach誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的變化。 6.主動脈血管壁LOX-1蛋白的表達： 6.1免疫熒光染色法定性檢測主動脈血管壁LOX-1蛋白的組織表達：正常對照組及糖尿病2周時大鼠主動脈血管壁基本未見或極少LOX-1蛋白的陽性表達，而6周時糖尿病大鼠主動脈內(nèi)皮層可見明顯的亮綠色熒光染色信號；胰

11、島素和牛磺酸干預(yù)組大鼠主動脈內(nèi)皮層的亮綠色熒光染色信號均明顯減弱減少。 6.2 Western Blot定量分析主動脈血管壁LOX-1蛋白表達量：ECL顯影結(jié)果及以β-actin蛋白表達為參照，圖像系統(tǒng)定量分析結(jié)果顯示，各組腹主動脈壁LOX-1在蛋白水平上均有表達，正常對照組和糖尿病2周時LOX-1蛋白表達水平極低，而糖尿病6周時LOX-1蛋白表達水平明顯高于正常對照組；胰島素、?；撬岣深A(yù)組LOX-1蛋白表達水平明顯降低，同糖尿

12、病組比較差異明顯，其中胰島素組LOX-1蛋白水平下降最明顯，但與正常對照組比較仍有差異。 7.主動脈血管壁NF-κ Bp65蛋白的表達 7.1免疫組織化學SP法檢測NF-κ Bp65蛋白的組織表達：NF-κ Bp65在所有大鼠主動脈血管內(nèi)皮層及肌層均有陽性表達，正常對照組和2周時糖尿病組表達很弱，僅極少內(nèi)皮和平滑肌細胞漿內(nèi)有稀疏淡染棕黃色染色顆粒；6周時糖尿病大鼠主動脈血管內(nèi)皮及平滑肌細胞內(nèi)均可見有密集的棕黃色陽性染色顆

13、粒，內(nèi)皮層細胞核內(nèi)亦出現(xiàn)棕色陽性染色顆粒；胰島素治療組和牛磺酸干預(yù)組內(nèi)皮層及平滑肌細胞均著色較淺，細胞核內(nèi)陽性表達信號亦明顯減弱減少。 7.2 Western Blot定量分析胸主動脈血管壁NF-κBp65蛋白的表達水平：顯影結(jié)果及圖像系統(tǒng)定量分析顯示，各組胸主動脈壁NF-κBp65蛋白均有表達，正常對照組和糖尿病2周時蛋白條帶顯影很弱，蛋白表達水平很低；糖尿病6周時蛋白條帶顯影較強，蛋白表達水平明顯高于正常對照組；胰島素治療、

14、?；撬岣深A(yù)組NF-κBp65蛋白表達水平明顯降低，同糖尿病組比較差異有統(tǒng)計學意義，其中胰島素治療組NF-κ Bp65蛋白表達水平降至接近正常水平。 8.胸主動脈血管壁ICAM-1蛋白的表達水平 免疫組織化學SP法檢測ICAM-1蛋白在主動脈壁的表達部位，計算機圖像分析系統(tǒng)計算內(nèi)皮細胞陽性染色平均積分光密度值作為ICAM-1蛋白表達水平顯示：ICAM-1主要表達于大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮層細胞。 9.RT-PCR定量檢

15、測主動脈血管壁LOX-1，NF-κ Bp65，ICAM-1 mRNA表達水平。 10.相關(guān)性分析：糖尿病大鼠血清oxLDL與NO水平、Rmax、NO/ET比值負相關(guān)，與血漿ET、血清sICAM-1水平正相關(guān)；主動脈內(nèi)皮最大舒張Rmax與ET、oxLDL、sICAM-1水平負相關(guān)，與NO、NO/ET正相關(guān)，二者均與血糖水平無明顯相關(guān)性。 研究結(jié)論： 1.糖尿病早期即可出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能及超微結(jié)構(gòu)損傷，內(nèi)皮依賴性血管舒

16、張反應(yīng)是最直接最敏感的內(nèi)皮功能損傷檢測指標；外周血NO、ET、NO/ET和sICAM-1水平可作為篩查內(nèi)皮功能障礙的早期間接指標。 2.糖尿病早期存在過強的LDL氧化修飾，oxLDL是誘導(dǎo)糖尿病早期血管內(nèi)皮功能障礙的獨立危險因子；外周血oxLDL水平可作為糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙的早期預(yù)測指標。 3.糖尿病早期血管內(nèi)皮功能損傷，同步發(fā)生了主動脈血管壁LOX-1蛋白和基因表達上調(diào)，且與血清oxLDL水平密切相關(guān)，表明oxLD

17、L與LOX-1相互作用介導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷，oxLDL/LOX-1系統(tǒng)是誘導(dǎo)糖尿病早期血管內(nèi)皮功能障礙的重要分子因素。 4.糖尿病早期主動脈壁NF-κ Bp65表達明顯增強，并伴有明顯核轉(zhuǎn)位，且其基因表達與LOX-1，ICAM-1mRNA表達正相關(guān)，提示糖尿病大鼠早期主動脈壁NF-κ B激活，NF-κ B信號通路活化誘導(dǎo)內(nèi)皮黏附因子ICAM-1表達參與了oxLDL/LOX-1誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷過程。 5.胰島素嚴格控制血糖對糖尿