P38MAPK-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)炎癥鼻黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞因子及糖皮質(zhì)激素受體的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究提示多種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)有助于黏膜炎癥的持續(xù)及加重。而阻斷個(gè)別因子或介質(zhì)難以達(dá)到治療目的。我們?cè)O(shè)想：通過阻斷炎癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的上游關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，進(jìn)而抑制細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，以達(dá)到切斷惡性循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)的目的。另糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是目前公認(rèn)的最有效的抗炎藥物，已用于治療CRS。但部分患者出現(xiàn)激素抵抗。而p38絲裂原活

2、化蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase，MAPK)及核因子-kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中最重要的蛋白激酶及轉(zhuǎn)錄因子，且參與多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的調(diào)控，并可能與激素不敏感相關(guān)。另外鼻黏膜上皮細(xì)胞因參與局部組織炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)控作用而被關(guān)注，我們以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致炎體外鼻黏膜上皮細(xì)胞為載體，試圖揭示P

3、38MAPK/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)炎癥鼻黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)以及糖皮質(zhì)激素受體的調(diào)控作用，為以P38MAPK/NF-κB為靶點(diǎn)的治療提供理論依據(jù)。
　　 另外，本課題同時(shí)對(duì)人鼻黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的酶消化分離細(xì)胞方法進(jìn)行探索性改進(jìn)，獲得足夠數(shù)量的原代細(xì)胞以實(shí)施上述實(shí)驗(yàn)。本研究分3章：
　　 第1章酶消化分離法原代培養(yǎng)人鼻黏膜上皮細(xì)胞的改進(jìn)
　　 目的：探索對(duì)酶消化分離法原代培養(yǎng)人鼻黏膜上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)

4、步驟和技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)，以提高原代培養(yǎng)成功率并獲得更多數(shù)量的原代細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供良好的培養(yǎng)模型。方法：在酶消化分離細(xì)胞、無血清培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，對(duì)取材處理、消化酶應(yīng)用等步驟進(jìn)行了改進(jìn)，如翻揭分離獲取黏膜層、消化中加入Ⅰ型DNA酶(DNase typeⅠ)、膠原酶消化后含黏膜塊的溶液中直接加入胰蛋白酶，以及應(yīng)用不包被的培養(yǎng)皿培養(yǎng)等。原代培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞經(jīng)免疫熒光組織化學(xué)染色細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)8/18進(jìn)行鑒定。

5、結(jié)果：鼻黏膜原代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，6～8d匯合可用于傳代或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CK8/18免疫熒光染色陽性鑒定為上皮源性細(xì)胞。結(jié)論：酶消化分離細(xì)胞、無血清培養(yǎng)法可成功建立人鼻黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)模型，對(duì)取材處理、酶消化等步驟進(jìn)行上述改進(jìn)，可以獲得更多數(shù)量以及純度較高的鼻黏膜上皮細(xì)胞。
　　 第2章NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)炎癥鼻黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞因子的調(diào)控及意義
　　 目的：探討脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘

6、導(dǎo)體外培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞致炎后核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的活性變化對(duì)局部細(xì)胞因子的調(diào)控作用，以及探索p38MAPK(mitogen-activited protein kinase，MAPK)對(duì)NF-κB激活的調(diào)節(jié)作用。方法：采用無血清原代培養(yǎng)法行正常鼻黏膜上皮細(xì)胞分離和培養(yǎng)，傳代3到4代后，經(jīng)LPS誘導(dǎo)以及加入NF-κB阻斷劑wedelolactone前后，應(yīng)用凝膠電泳遷移率分析法(el

7、ectrophoretic mobility shiftassay，EMSA)檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)細(xì)胞因子(IL-1β，TNF-α，IL-5，IL-6，IL-8，GM-CSF，RANTES，eotaxin,eotaxin-2)，黏附分子(VCAM-1，ICAM-1)和炎性介質(zhì)(iNOS，COX-2)mRNA的表達(dá)水平。進(jìn)一步采用EMSA法檢測(cè)p38MAPK特異阻斷劑SB20358

8、0對(duì)NF-κB DNA結(jié)合活性的影響。結(jié)果：LPS(1mg/L)誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞使NF-κB DNA結(jié)合活性明顯增強(qiáng)(p=0.004)，并使IL-1β，IL-8和COX-2 mRNA的表達(dá)水平增高(p=0.000)；其它因子未誘導(dǎo)出表達(dá)；應(yīng)用NF-κB阻斷劑wedelolactone后NF-κB結(jié)合活性以及IL-1β，IL-8和COX-2 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，與LPS誘導(dǎo)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值分別為0.002，0.000，0.0

9、00，0.000)；應(yīng)用p38MAPK阻斷劑SB203580可部分下調(diào)LPS誘導(dǎo)的NF-κB DNA結(jié)合活性的增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.036)。結(jié)論：NF-κB通路參與了對(duì)LPS體外誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞IL-1β，IL-8和COX-2轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；p38MAPK參與了對(duì)LPS致炎鼻黏膜上皮細(xì)胞NF-κB結(jié)合活性的調(diào)節(jié)。
　　 第3章 p38MAPK/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)炎癥鼻黏膜上皮細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

10、>　　 目的：探討p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase，MAPK)和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)炎癥鼻黏膜上皮細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用，以及p38MAPK在上述機(jī)制中對(duì)NF-κB的調(diào)控作用。方法：采用蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)脂多糖(lipo

11、polysaccharide，LPS)以不同濃度和于不同時(shí)間加入培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞后活化的p38MAPK(磷酸化p38MAPK)表達(dá)的變化，及加入p38MAPK特異性阻斷劑SB203580對(duì)其活性的抑制作用；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測(cè)LPS致炎鼻黏膜上皮細(xì)胞后GR亞型GRα和GRβ轉(zhuǎn)錄水平的變化，以及加入SB203580

12、和NF-κB阻斷劑Wedelolactone后對(duì)受體mRNA表達(dá)的抑制作用；應(yīng)用凝膠電泳遷移率分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)法檢測(cè)SB203580對(duì)NF-κB DNA結(jié)合活性的抑制作用。結(jié)果：隨著LPS濃度的增加(0.01mg/L，0.1mg/L)，鼻黏膜上皮細(xì)胞中磷酸化p38MAPK的表達(dá)升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.424，0.99)；當(dāng)LPS的刺激濃度為1mg/L時(shí)表達(dá)最

13、高(p=0.001)；濃度為10Mg/L時(shí)不再繼續(xù)升高(p=.002)。LPS刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞15min時(shí)磷酸化p38MAPK的表達(dá)即升高(p=0.006)；30min時(shí)表達(dá)最高(p=0.009)；45min后漸降(p=.021)，60min時(shí)表達(dá)量已經(jīng)很低，與未加LPS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=1.000)。在加入LPS之前30min加入p38特異性阻斷劑SB203580可抑制p38MAPK活性(p=.001)。未加LPS時(shí)，GR

14、αmRNA即有較高表達(dá)，而GRβ mRNA表達(dá)微量；LPS誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞GRβ mRNA表達(dá)顯著升高(p=0.011)，且能被SB203580抑制以及被Wedelolactone不完全抑制，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.01)。而GRα在LPS刺激后雖有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.05)，且未能被阻斷劑抑制。LPS刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞后NF-κB的DNA結(jié)合活性升高，可被SB203580部分抑制(p=0.036)。結(jié)論：