深低溫停循環(huán)下腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及腦保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)深低溫下停循環(huán)90min后腦神經(jīng)形態(tài)學(xué)及凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax表達(dá)的研究，以及DHCA時(shí)給予間斷順行腦灌注(intermittentantegradecerebralperfusion，IACP)(簡(jiǎn)稱順灌)和逆行腦灌注(retrogradecerebralperfusion，RCP)(簡(jiǎn)稱逆灌)兩種腦保護(hù)方法腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及bcl-2、bax基因表達(dá)變化的研究，探索DHCA時(shí)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控機(jī)制及順灌和逆灌

2、的腦保護(hù)機(jī)制，為臨床更好的腦保護(hù)方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康成年雜種犬(由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)24只，雌雄各半，體重18-22kg，隨機(jī)分為四組，每組6只。A組：常溫體外循環(huán)組(簡(jiǎn)稱NCPB組)；B組：深低溫停循環(huán)組(簡(jiǎn)稱DHCA組)；C組：深低溫停循環(huán)+間斷選擇性順行腦灌注組(簡(jiǎn)稱IACP組)；D組：深低溫停循環(huán)+逆行腦灌注組(簡(jiǎn)稱RCP組)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取左側(cè)臥位，經(jīng)右第4肋間進(jìn)胸，全身肝素化后經(jīng)升主

3、動(dòng)脈插動(dòng)脈灌注管，近端插停跳液針，行上腔靜脈插管及下腔靜脈插管。NCPB組：常規(guī)建立體外循環(huán)(不降溫)，升主動(dòng)脈及上、下腔靜脈不阻閉，行并行循環(huán)。DHCA組：常規(guī)建立體外循環(huán)，阻閉升主動(dòng)脈及上、下腔靜脈，鼻咽溫降至18℃時(shí)停循環(huán)。IACP組：停循環(huán)前步驟同DHCA組，在停循環(huán)期間，通過主動(dòng)脈插管灌注弓部3支血管，每15min灌注1次，每次灌注1min，灌注流量50ml/(kg·min)。RCP組：停循環(huán)前步驟同DHCA組，停循環(huán)后，結(jié)扎

4、奇靜脈，在停循環(huán)期間，通過上腔靜脈逆行灌注，維持灌注壓在25mmHg左右。DHCA組、IACP組、RCP組均停循環(huán)90min，各組總轉(zhuǎn)機(jī)時(shí)間均為120min，然后停機(jī)，手術(shù)結(jié)束后迅速開顱取海馬組織，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)和免疫組化方法檢測(cè)bcl-2和bax在海馬組織中的表達(dá)，并取標(biāo)本進(jìn)行透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)觀

5、察神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、電鏡下觀察海馬組織神經(jīng)細(xì)胞：NCPB組神經(jīng)細(xì)胞未見明顯凋亡改變；DHCA組可見神經(jīng)細(xì)胞線粒體腫脹，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞器減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不完整，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞可見核染色質(zhì)溶解；IACP組中，神經(jīng)細(xì)胞線粒體腫脹不明顯，偶有細(xì)胞質(zhì)松散、核腫脹。RCP組可見神經(jīng)細(xì)胞核、線粒體腫脹，無(wú)染色質(zhì)邊集、溶解，毛細(xì)血管壁細(xì)胞及血管周圍組織水腫明顯。 2、免疫組化及RT-PCR檢測(cè)bcl-2、bax基因

6、表達(dá)，bcl-2在NCPB組表達(dá)最低，DHCA組表達(dá)明顯，而IACP組表達(dá)最強(qiáng)，RCP組表達(dá)稍低于IACP組，四組間存在顯著性差異，P＜0.01。Bax在NCPB組表達(dá)低，在DHCA組表達(dá)最強(qiáng)，而在IACP組和RCP組表達(dá)明顯，但兩組間差別不明顯P＞0.05，其它組間存在顯著性差異，P＜0.01。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1、DHCA時(shí)引起bcl-2和bax兩種基因表達(dá)，以bax表達(dá)增強(qiáng)明顯，導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡。 2