AVM誘導(dǎo)王鴿腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路研究.pdf

1、阿維菌素（avermectin，AVM）在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中大量應(yīng)用并造成嚴(yán)重的環(huán)境毒性。以往研究表明鴿子AVM中毒可引起明顯的神經(jīng)癥狀、腦組織出血和水腫以及腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡等變化，證實(shí)了AVM能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡并且研究了引起細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，但是關(guān)于另一條導(dǎo)致細(xì)胞凋亡重要的途徑—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑未見報(bào)道。
　　 本試驗(yàn)以體外培養(yǎng)王鴿腦神經(jīng)細(xì)胞為研究對(duì)象，在培養(yǎng)液中添加2.5μg·L-1、5μg·L-1、10μg·L-1三種劑量

2、AVM，進(jìn)行6h、12h和24h不同時(shí)間段的染毒處理，通過(guò)對(duì)王鴿腦神經(jīng)細(xì)胞的存活率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)以及細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Cyt-c、DADD153、GRP78和Caspase-12 mRNA表達(dá)等進(jìn)行觀察和檢測(cè)，探討了AVM對(duì)鴿神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，以闡述AVM對(duì)神經(jīng)細(xì)胞影響的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)機(jī)制。研究結(jié)果表明：
　　 1.應(yīng)用透射電鏡、MTT法以及TUNEL法，觀察培養(yǎng)液中添加不同劑量AVM在

3、培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，從形態(tài)學(xué)角度觀察AVM能夠引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且明確細(xì)胞凋亡率與AVM作用程度呈線性相關(guān)；
　　 2.應(yīng)用氧化應(yīng)激系列檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性情況，結(jié)果顯示AVM能引起神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性下降，超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，活性氧（ROS）水平升高，且呈劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)

4、，提示AVM可通過(guò)氧化應(yīng)激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而開啟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
　　 3.應(yīng)用半定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明AVM能夠引起鴿神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2mRNA表達(dá)水平下降，從而失去Bcl-2的保護(hù)作用，引起細(xì)胞凋亡；
　　 4.應(yīng)用半定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GRP78 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明試驗(yàn)組的GRP78 mRNA表達(dá)隨著攻毒劑量的增加和染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在

5、攻毒5μg/mLAVM、24h后達(dá)峰值，隨后降低，提示此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身的保護(hù)作用達(dá)到最佳水平；
　　 5.應(yīng)用半定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cyt-c mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明Cyt-c在正常情況下的表達(dá)量較低，隨著藥物作用程度的增大而明顯的增加，表明神經(jīng)細(xì)胞凋亡的早期就已經(jīng)啟動(dòng)了Cyt-c的調(diào)控作用；
　　 6.應(yīng)用半定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GADD153 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明AVM能夠引起鴿神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)GAD

6、D 153mRNA表達(dá)水平增加，進(jìn)入其級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
　　 7.應(yīng)用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果提示AVM能夠引起鴿神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 mRNA表達(dá)水平增加，它作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的標(biāo)志性基因，證明了AVM能夠通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑引起細(xì)胞凋亡。
　　 本試驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑相關(guān)分子的表達(dá)各個(gè)方面闡明了AVM毒性作用