高糖和晚期糖基化終產(chǎn)物對單核細胞氧化應激及血紅素加氧酶1的影響.pdf

1、隨著人民生活水平的提高，生活方式的改變，無論是在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家2型糖尿病的患病率均明顯增加。近20年來我國2型糖尿病患病率急劇上升，2001年中華糖尿病學會對30省市住院病人調(diào)查的結(jié)果顯示在糖尿病患者中，合并高血壓、心腦血管疾病的患者占60％，合并腎臟、眼病患者各占34％，慢性血管并發(fā)癥已經(jīng)成為糖尿病致殘和致死的主要原因。但是，目前糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機制尚未闡明，是一直以來的研究難點和熱點問題。因此進一步深入探討糖尿病慢性

2、并發(fā)癥的發(fā)病機制對尋求有效的防治途徑具有極其重要的意義。 2004年美國糖尿病學會(ADA)年會中，Banting獎得主Brownlee教授作了題為“糖尿病慢性并發(fā)癥的病理生理學：一個共同的機制”的演講，提出線粒體電子傳遞鏈在電子傳遞過程中導致的過氧化物產(chǎn)生過多是高血糖誘導血管損傷的共同機制，其核心是高糖引起線粒體中超氧陰離子生成過多，導致組織細胞中發(fā)生氧化應激，而氧化應激可引起多元醇(polyol)通路的激活、糖基化終末產(chǎn)物(

3、advancedglycationendproducts，AGEs)的形成、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)途徑及氨基己糖途徑的激活，引起細胞代謝功能紊亂，最終導致糖尿病的各種慢性并發(fā)癥。這標志著對糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)病機制的認識有了一個突破性的進展。 近年來血紅素加氧酶(hemeoxygenase，HO)在拮抗氧化應激中的重要作用正日益受到關注。HO為體內(nèi)血紅素降解的限速酶，HO通過降解血紅素產(chǎn)生一氧化碳(ca

4、rbonmonoxide，CO)、膽綠素和鐵離子，膽綠素進一步經(jīng)膽綠素還原酶作用生成膽紅素(bilirubin，BR)，而鐵離子能誘導鐵蛋白的合成，這些代謝產(chǎn)物均可通過不同途徑發(fā)揮抗氧化作用。HO在體內(nèi)分為誘生型HO-1及原生型HO-2、HO-3。HO-1為應激蛋白，主要分布在網(wǎng)狀內(nèi)皮含量豐富的組織中，肝、脾內(nèi)含量最高，底物血紅素、重金屬、過氧化物、紫外線、高鹽、高氧缺氧等應激狀態(tài)均可上調(diào)HO-1表達水平。糖尿病慢性血管并發(fā)癥發(fā)病機制的

5、中心環(huán)節(jié)主要是氧化應激，但目前對糖尿病狀態(tài)下HO-1的改變研究還比較少。已有的研究發(fā)現(xiàn)，HO-1的抗氧化損傷的生理特性在糖尿病中的作用表現(xiàn)在：對胰島細胞的保護作用，對血管病變中的內(nèi)皮細胞、單核巨噬細胞及平滑肌細胞的保護作用，亦有研究提示利用誘導劑增加HO-1的表達即其產(chǎn)物的生成有助于減輕高血糖對靶器官的損傷，減少或者延緩并發(fā)癥的發(fā)生。由此，深入研究HO-1與糖尿病這種病理生理狀態(tài)之間的關系對于預防和治療糖尿病的慢性并發(fā)癥是很有意義的。

6、 第一章：高糖和晚期糖基化終產(chǎn)物對THP-1細胞氧化應激及HO-1表達的影響 [目的]： 1、探討不同濃度的葡萄糖和AGEs刺激下，THP-1細胞活性氧產(chǎn)量在不同時間點的變化情況 2、探討高糖和AGEs聯(lián)合刺激對THP-1細胞氧化應激的影響 3、探討高糖和AGEs聯(lián)合刺激時THP-1細胞HO-1mRNA的表達情況 [方法]： 1、細胞培養(yǎng)以上海細胞庫提供的THP-1人單核細胞白血病細

7、胞株為研究對象，配制含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)THP-1細胞，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。 2、體外制備AGE修飾牛血清白蛋白(AGE—BSA)參考文獻[11-12]的方法體外制備，簡要步驟如下：將3.55mg/mlBSA與葡萄糖一超37℃孵育60天，4度下透析袋透析24小時去除未結(jié)合的葡萄糖。體外制備的AGE—BSA經(jīng)抗AGE抗體ELISA法和熒光分光光度法鑒定，制備的AGE—BSA樣品中，AGE含量為1

8、01.29U/mg蛋白，BSA對照樣品為13.68U/mg蛋白，所有樣品均經(jīng)TCL試劑盒(Endos公司，美國)檢測，內(nèi)毒素含量低于0.25EU/ml。 3、ROS的流式細胞儀檢測將培養(yǎng)好的細胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別用5、15、25mmol/LD—GLU或者25、50、100μg/ml上述制備的AGE—BSA刺激細胞，0.5、2、6、24h后收集細胞，細胞收集后調(diào)整細胞濃度為(105-107)/ml，嚴格按照活性氧檢測試劑盒說

9、明裝載、洗滌DCFH—DA探針，在激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長525nm條件下，流式細胞儀檢測各組細胞內(nèi)ROS熒光強度。 4、細胞培養(yǎng)液上清中TNF—α分泌的ELISA檢測將培養(yǎng)好的THP-1細胞種植于六孔培養(yǎng)板中，分別加入不同的處理因子，孵育24h后收集上清液，用hTNF—αELISA試劑盒檢測其中TNF—α濃度，嚴格按照試劑盒步驟進行。標本的吸光度在波長450nm下利用酶標儀檢測，TNF—α的水平根據(jù)標準曲線定量，標準曲線設

10、定定量范圍為：12.5-1000pg/ml。 5、細胞培養(yǎng)液上清中MDA含量的檢測上清的收集方法同上，利用TBA法，即硫氮巴比妥酸法，嚴格按照試劑盒說明步驟進行。 6、半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測細胞內(nèi)HO-1mRNA的表達將培養(yǎng)好的單核細胞種植于六孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細胞濃度為105/ml以上，分別加入不同的處理因子，孵育24h后收集培養(yǎng)板內(nèi)細胞，提取總RNA，行RT—PCR，擴增產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳。 7

11、、統(tǒng)計學處理所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)來表示。統(tǒng)計由SPSS13.0完成，采用析因設計資料的方差分析方法分析組間差異，利用Spearman相關系數(shù)的非參數(shù)方法分析非雙變量正態(tài)分布資料之間的相關分析，顯著性標準為0.05。 [結(jié)論]： 1、高糖、AGEs刺激THP-1細胞ROS產(chǎn)生增加，且具有濃度—時間依賴性，二者聯(lián)合刺激時ROS產(chǎn)生更多，差異具有統(tǒng)計學意義，提示二者之間在致氧化應激的過程中可能具有協(xié)同作用

12、。 2、高糖和AGEs聯(lián)合刺激可使THP-1細胞表達氧化應激損傷指標MDA、TNF—α產(chǎn)生增加，提示THP-1細胞存在氧化應激損傷。 3、高糖和AGEs聯(lián)合刺激可誘導THP-1細胞內(nèi)HO-1mRNA的表達，提示HO-1做為一個應激反應蛋白，可能在高糖和AGEs所致氧化應激狀態(tài)下發(fā)揮細胞保護作用。但氧化系統(tǒng)增加的幅度超過抗氧化系統(tǒng)增加的幅度，細胞自身的代償反應仍不足以抵消氧化應激造成的損傷。 第二章：晚期糖基化終產(chǎn)

13、物對健康成人外周血單核細胞TNF—α和HO-1表達的影響 [目的]探討不同濃度晚期糖基化終產(chǎn)物(advancedglycationend—products，AGEs)對健康成人外周血單核細胞腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactora，TNF—α)及血紅素加氧酶1(hemeoxygenase1，HO-1)表達的影響。 [方法]： 1、人外周血單核細胞的分離[13-14]取肝素抗凝血，以磷酸鹽緩沖液(P

14、BS)稀釋1倍，顛倒混勻，輕輕置于淋巴細胞分離液上，使細胞懸液與分離液體積比為2：1，2000轉(zhuǎn)離心20min，以玻璃吸管吸出中間膜樣的單個核細胞成分，PBS沖洗3次，每次離心1000轉(zhuǎn)10min。再利用Percoll密度梯度分離液提取單核細胞層即得單核細胞。以此方法分離的單核細胞，經(jīng)臺盤蘭拒染試驗，測得活細胞數(shù)大于90％。 2、AGEs的制備及濃度測定同第一章 3、AGEs對人外周血單核細胞分泌TNF—α的影響將分離好

15、的單核細胞種植于六孔培養(yǎng)板中，分別加入100、200μg/ml的AGE—BSA，對照組加入BSA，孵育4h、24h后收集上清液，用hTNF—αELISA試劑盒檢測其中TNF—α濃度，嚴格按照試劑盒步驟進行。 4、RT—PCR法測定HO-1mRNA的表達細胞的處理同上，在4h、24h時收集細胞，利用Trizol試劑法提取細胞RNA，行RT—PCR。 5、數(shù)據(jù)處理所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)來表示。統(tǒng)計由SPS