TF-Ⅶa介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞粘附、遷移及機(jī)制研究.pdf

1、目前研究比較肯定的與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的粘附分子有鈣粘附素、選擇素、整合素、免疫球蛋白超家族、CD44分子等，其中整合素與腫瘤的研究比較深入和廣泛。 整合素是細(xì)胞外基質(zhì)成分的受體，腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)整合素，整合素與腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)相互作用影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移到其他組織的能力，目前認(rèn)為它是腫瘤細(xì)胞粘附、遷移所必須的。研究已經(jīng)表明：整合素可通過(guò)與胞外基質(zhì)作用，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子如FAK、Sn等，參與腫瘤粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。 組織

2、因子(TF)是體內(nèi)重要的凝血因子，除具有凝血活性外，其與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系甚為密切。TF影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍未完全闡明，迄今研究表明FⅦa/TF復(fù)合物影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移可能機(jī)制有：1.影響纖溶活性；2.調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的血管生成-抗血管生成平衡；3.調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄；4.影響細(xì)胞骨架系統(tǒng)。 近期研究提示，TF具有信號(hào)傳導(dǎo)受體的功能，多種腫瘤細(xì)胞可高表達(dá)TF，作為腫瘤細(xì)胞表面的受體，TF是否能與Ⅶa結(jié)合，能否激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的信號(hào)蛋

3、白參與腫瘤細(xì)胞的遷移，關(guān)于該方面的研究不多，國(guó)內(nèi)尚無(wú)此研究報(bào)道。本文擬用高表達(dá)TF的乳腺癌MDA-MB231(也表達(dá)整合素α5β1)為對(duì)象，研究TF與FⅦa介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞粘附、伸展、遷移，以及TF與FⅦa粘附后FAK的激活，探討TF在腫瘤粘附、遷移中的作用。 研究已表明：α4β1、α5β1、α8β1、αvβ1整合素均可特異的與細(xì)胞外基質(zhì)中的FN粘附后激活FAK等信號(hào)分子，影響腫瘤細(xì)胞的遷移。本研究中選擇的MDA-MB231乳腺癌

4、細(xì)胞也可表達(dá)整合素α5β1。 多聚賴氨酸是常用的細(xì)胞粘附劑，它可與細(xì)胞發(fā)生物理性粘附，并不影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)及相關(guān)生物學(xué)功能的改變。本文選擇后兩者作為對(duì)照，試圖揭示TF介導(dǎo)的粘附、遷移的特異性。 第一部分:組織因子和凝血因子Ⅶa結(jié)合誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞粘附 目的：探討凝血因子Ⅶa作為細(xì)胞外基質(zhì)能否以配受體結(jié)合方式與乳腺癌細(xì)胞表面TF發(fā)生粘附。并以多聚賴氨酸、纖連蛋白作為對(duì)照觀察比較粘附的不同。 方法：分別將Ⅶa，纖

5、連蛋白(FN)，多聚賴氨酸(P-L-Lysine)包被于96孔培養(yǎng)板孔底，腫瘤細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)夜，然后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中開(kāi)蓋孵育30、60、90min后，測(cè)定570nm的吸光度，用吸光度值來(lái)反映定量細(xì)胞粘附數(shù)目。 結(jié)果：粘附30min時(shí)凝血因子Ⅶa組：570nm吸光度值為0.4306±0.0030纖連蛋白組值為0.4530±0.0147，多聚賴氨酸組的值為0.4437±0.0147；在60min時(shí)

6、凝血因子Ⅶa組：570nm的吸光度值為0.4570±0.0075，纖連蛋白組值為0.4733±0.0152，多聚賴氨酸組的值為0.48267±0.0094；在90min時(shí)凝血因子Ⅶa組：570nm的吸光度值為0.4680±0.0120，纖連蛋白組值為0.4730±0.0120，多聚賴氨酸組的值為0.4850±0.0781，P＞0.05，比較無(wú)差異。在粘附系統(tǒng)里加入Ab-TF或Ab-Ⅶa，Ⅶa組粘附的細(xì)胞減少，而纖連蛋白組、多聚賴氨酸組細(xì)

7、胞粘附數(shù)目基本無(wú)改變。 結(jié)論：凝血因子Ⅶa可作為細(xì)胞外基質(zhì)與乳腺癌細(xì)胞表面的TF特異性結(jié)合參與細(xì)胞粘附。 第二部分:組織因子和凝血因子Ⅶa結(jié)合誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞伸展 目的：通過(guò)觀察凝血因子Ⅶa作為細(xì)胞外基質(zhì)與乳腺癌細(xì)胞表面TF發(fā)生粘附后細(xì)胞伸展形態(tài)，并以多聚賴氨酸、纖連蛋白作為對(duì)照比較伸展形態(tài)的不同，探討TF與整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附后伸展的不同。 方法：將分別將Ⅶa、纖連蛋白、多聚賴氨酸包被于6.5CM培養(yǎng)皿，

8、將在無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中開(kāi)蓋孵育30、60、90min后，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞伸展的狀態(tài)，并拍照。 結(jié)果：凝血因子Ⅶa與細(xì)胞表面TF粘附結(jié)合后30分鐘已經(jīng)可見(jiàn)細(xì)胞表面伸出很微小的偽足，細(xì)胞的形態(tài)相對(duì)規(guī)整，60、90min細(xì)胞表面伸展?fàn)顟B(tài)無(wú)明顯差異；與纖連蛋白粘附結(jié)合后30min可見(jiàn)細(xì)胞膜表面有刺狀突起，60、90min細(xì)胞向四周伸展，細(xì)胞形態(tài)明顯變得不規(guī)則，細(xì)胞在基質(zhì)上的伸展

9、形態(tài)與前者不同，細(xì)胞與多聚賴氨酸粘附后，僅看到很少的細(xì)胞膜表面有突起或偽足。 結(jié)論：凝血因子Ⅶa作為細(xì)胞外基質(zhì)與乳腺癌細(xì)胞表面的TF粘附后細(xì)胞伸展，它與以纖連蛋白為基質(zhì)，由整合素介導(dǎo)的粘附伸展形態(tài)不同，說(shuō)明組織因子和整合素參與的細(xì)胞粘附可能由不同的細(xì)胞骨架蛋白所介導(dǎo)。 第三部分:組織因子和凝血因子Ⅶa結(jié)合誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng) 目的：探討凝血因子Ⅶa作為細(xì)胞外基質(zhì)以配受體結(jié)合方式與乳腺癌細(xì)胞表面TF粘附后細(xì)胞發(fā)

10、生遷移，并以纖連蛋白作為對(duì)照比較細(xì)胞遷移的不同。 方法：使用改良的Bodyen小室研究乳腺癌細(xì)胞的遷移。分別將Ab-TF、纖連蛋白包被于Bodyen小室下室的PVDF膜，將細(xì)胞接種于小室的上室，在37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，固定、染色后計(jì)數(shù)遷移到下室膜背面的細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果：細(xì)胞可穿過(guò)包被有Ab-TF、纖粘連蛋白的PVDF膜，穿膜后遷移到膜背面的細(xì)胞數(shù)目分別為109.67±4.06和118.67±2.603，P

11、=0.135＞0.05，無(wú)差異。 結(jié)論：乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231不僅可穿過(guò)包被Ab-TF的PVDF膜，而且可穿過(guò)包被纖粘連蛋白的PVDF膜，類似整合素方式，TF介導(dǎo)細(xì)胞粘附、進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞遷移，是細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的前提步驟。 第四部分:粘著斑激酶在TF/FⅦa介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞粘附、遷移中的作用 目的：探討粘著斑激酶(FAK)在TF與FⅦa介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞粘附、遷移中的作用。方法：將Ⅶa、纖粘連蛋白、多聚賴氨酸包

12、被于6.5CM培養(yǎng)皿，將在無(wú)血清培養(yǎng)基過(guò)夜的細(xì)胞，接種于6.5CM的細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中開(kāi)蓋孵育60分鐘后，輕輕洗掉未粘附的細(xì)胞，提取蛋白，使用免疫沉淀和免疫印跡檢測(cè)FAK及其磷酸化。 結(jié)果：凝血因子Ⅶa與細(xì)胞粘附后60min后可檢測(cè)到粘著斑激酶的磷酸化，同樣細(xì)胞與FN粘附結(jié)合后60min激活粘著斑激酶，而細(xì)胞與多聚賴氨酸的粘附結(jié)合60min后，未激活粘著斑激酶。 結(jié)論：粘著斑激酶是TF/FⅦa介

13、導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞粘附、遷移中的重要信號(hào)分子。 第五部分: 一、兩種不同的乳腺癌細(xì)胞組織因子表達(dá)與細(xì)胞侵襲力比較研究 目的：比較兩種不同的乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB231TF表達(dá)的差異，揭示TF與腫瘤侵襲力的關(guān)系。 方法：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB231表面TF表達(dá)差異，RT-PCR法檢測(cè)兩種乳腺癌細(xì)胞系的TFmRNA表達(dá)水平，用改良的Bodyen小室法研究細(xì)胞的侵襲力，用

14、細(xì)胞穿膜的數(shù)目代表侵襲力，t檢驗(yàn)差異性。 結(jié)果：MDA-MB231細(xì)胞TFmRNA和抗原表達(dá)明顯高于MCF-7細(xì)胞，而且MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞的侵襲力高于MCF-7，穿膜數(shù)目分別為351.67±3.78和155.66±4.72，P=0.00＜0.05。 結(jié)論：TF表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞侵襲力相關(guān)。 二、凝血酶誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7組織因子表達(dá) 目的：探討凝血酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7TFmRNA和蛋

15、白表達(dá)的影響。 方法：凝血酶以不同濃度0.5、1.0、10U/ml，不同時(shí)間(1、2、3、4、6、24小時(shí))刺激乳腺癌細(xì)胞后用RT-PCR檢測(cè)TFmRNA，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面TF蛋白表達(dá)水平. 結(jié)果：濃度為1U/ml的凝血酶，作用細(xì)胞3小時(shí)TFmRNA和4小時(shí)TF蛋白表達(dá)最高。 結(jié)論：凝血酶上調(diào)腫瘤TF表達(dá)，作為一個(gè)正反饋效應(yīng)擴(kuò)大腫瘤細(xì)胞表面凝血酶生成，將進(jìn)一步加重腫瘤細(xì)胞局部纖維蛋白沉積和血栓形成從而促進(jìn)腫

16、瘤轉(zhuǎn)移。 三、組織因子在乳腺癌表達(dá)的臨床研究 目的：探討組織因子(Tissuefactor，TF)在乳腺癌表達(dá)的臨床意義和診斷價(jià)值。 方法：用免疫組化方法(S-P法)檢測(cè)39例乳腺癌手術(shù)切除組織中TF的表達(dá)。 結(jié)果：(1)TF表達(dá)陽(yáng)性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中明顯高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者，P＜0.05(2)TF在低分化組織中表達(dá)率高于中分化者。(3)TF和病人年齡無(wú)關(guān)。(4)TF表達(dá)與雌激素受體(estrogenrec

17、eptor，ER)、孕激素受體(progestinreceptor，PR)表達(dá)未顯示出相關(guān)性。 結(jié)論：TF表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化程度密切相關(guān)，可能是反映乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移潛能的生物學(xué)指標(biāo)。 四、組織因子mRNA在乳腺癌實(shí)體組織表達(dá) 目的：探討TFmRNA在乳腺實(shí)體癌表達(dá)的臨床意義。 方法：用RT-PCR方法檢測(cè)12例乳腺癌中TFmRNA表達(dá)。 結(jié)果：(1)TFmRNA在Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌中不表