2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、乳腺癌細(xì)胞的耐藥性是近年來乳腺癌患者化療失敗、復(fù)發(fā)率高的一個(gè)主要原因。其耐藥機(jī)制有凋亡抑制、耐藥相關(guān)蛋白的高表達(dá)、微小RNA的異常表達(dá)等。外泌體(exosome)是一種由細(xì)胞分泌的納米級(jí)小囊泡,富含多種RNAs、脂質(zhì)及蛋白質(zhì),它可以作為信息載體,在細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)和信息的傳遞。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、免疫耐受以及耐藥性密切相關(guān)。另外,有研究報(bào)道了多種microRNA與腫瘤的耐藥性相關(guān)。例如:miR-302,miR-369,

2、miR-200c,miR-34a,miR-222等。因此,本研究以乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體為研究對(duì)象,探討乳腺癌細(xì)胞外泌體及其相關(guān)miRNA與腫瘤耐藥性的關(guān)系,及其可能的作用機(jī)制,為腫瘤多藥耐藥的基因治療提供新的思路。
  一、外泌體在乳腺癌細(xì)胞間傳遞阿霉素耐藥性
  目的:提取乳腺癌細(xì)胞外泌體并進(jìn)行鑒定,觀察MCF-7/ADR細(xì)胞的外泌體能否在細(xì)胞間傳遞阿霉素耐藥性。
  方法:
  1外泌體的提取與鑒定:采用試

3、劑盒和超高速離心的方法提取人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人乳腺癌耐阿霉素(adriamycin,ADR)細(xì)胞MCF-7/ADR的外泌體,用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)與大小,并運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)外泌體的跨膜蛋白CD9的表達(dá)水平。
  2外泌體對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7耐藥性的影響:提取MCF-7/ADR細(xì)胞外泌體(ADR/exo),BCA法對(duì)外泌體進(jìn)行定量;將ADR/exo用DiO進(jìn)行染色標(biāo)記,用激光共聚焦顯微鏡觀察ADR/e

4、xo是否可以通過胞吞作用進(jìn)入MCF-7細(xì)胞;用MTT法檢測(cè)ADR/exo與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)后, MCF-7細(xì)胞的增殖率,以及對(duì)阿霉素的耐藥性的變化。
  結(jié)果:
  1.通過試劑盒和超高速離心法都可以得到人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADR的外泌體。透射電子顯微鏡下,外泌體大小為30-100 nm,呈現(xiàn)雙層膜的結(jié)構(gòu)。Western Blot結(jié)果顯示,外泌體跨膜蛋白CD9高水平表達(dá)。
  2

5、.激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示, MCF-7/ADR細(xì)胞的外泌體(ADR/exo)與敏感株細(xì)胞MCF-7共培養(yǎng)時(shí),ADR/exo可以進(jìn)入MCF-7細(xì)胞內(nèi)部。MTT結(jié)果顯示,與ADR/exo共培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞的增殖能力顯著降低,差異具有顯著性(P<0.05)。隨著外泌體含量由多到少, MCF-7細(xì)胞的增殖能力依次下調(diào)16%、24%、43%、24%。MTT結(jié)果顯示,MCF-7細(xì)胞與ADR/exo共培養(yǎng)后,對(duì)阿霉素的耐藥性明顯提高,差異具有顯

6、著性(P<0.05)。由高濃度到低濃度,對(duì)阿霉素的耐藥性依次增加5%、25%、40%、30%、29%、24%。
  結(jié)論:
  1.人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和其耐藥株MCF-7/ADR都可以分泌外泌體,通過試劑盒和超高速離心法都可以提取得到,得到的外泌體高表達(dá)CD9跨膜蛋白。
  2.MCF-7/ADR細(xì)胞的外泌體能夠進(jìn)入MCF-7細(xì)胞內(nèi)部,使細(xì)胞的增殖能力降低,并通過某些機(jī)制在細(xì)胞間傳遞阿霉素耐藥性,使受體細(xì)胞對(duì)阿霉素

7、的耐藥性明顯提高。
  二、乳腺癌細(xì)胞外泌體及其相關(guān)miRNA與腫瘤耐藥性的關(guān)系
  目的:分析乳腺癌細(xì)胞及其外泌體中耐藥相關(guān)microRNA的表達(dá)差異,選取目標(biāo)microRNA分子,用軟件預(yù)測(cè)其可能的靶分子,通過microRNA分子類似物和抑制劑研究目標(biāo)分子及其靶分子的表達(dá)變化,探討乳腺癌細(xì)胞外泌體及其相關(guān)miRNA與阿霉素耐藥性的關(guān)系,及其可能的作用機(jī)制。
  方法:
  1.耐藥相關(guān)的microRNA分子的

8、篩選:利用給total RNA加尾的方法,運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)在microRNA的水平對(duì)MCF-7細(xì)胞、MCF-7/ADR細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞外泌體(MCF-7/exo)、MCF-7/ADR細(xì)胞外泌體(ADR/exo)的多個(gè)耐藥相關(guān)的microRNA的表達(dá)進(jìn)行定量分析,篩選出表達(dá)差異大的目標(biāo)microRNA分子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
  2.目標(biāo)microRNA分子在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)可能的靶分子的篩選:利用生物信息學(xué)軟件,預(yù)測(cè)與乳腺癌耐藥性

9、相關(guān)的,與目標(biāo)microRNA分子的3'UTR區(qū)有部分結(jié)合的靶基因。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)在mRNA的水平對(duì)MCF-7細(xì)胞、MCF-7/ADR細(xì)胞、MCF-7/exo、ADR/exo中的多個(gè)靶基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析,篩選出可能的靶基因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
  3.目標(biāo) microRNA分子與細(xì)胞內(nèi)靶分子的作用關(guān)系:合成目標(biāo)microRNA分子類似物及其抑制劑,并將其轉(zhuǎn)染入 MCF-7細(xì)胞、MCF-7/ADR細(xì)胞。qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)

10、胞及其外泌體中目標(biāo)microRNA分子及其靶蛋白的mRNA表達(dá)變化。Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的表達(dá)變化。
  4.目標(biāo) microRNA分子對(duì)乳腺癌細(xì)胞耐藥性的影響:將目標(biāo)microRNA分子類似物或抑制劑轉(zhuǎn)染入MCF-7/ADR細(xì)胞,MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性的變化。
  結(jié)果:
  1.qRT-PCR結(jié)果顯示,與MCF-7細(xì)胞和MCF-7/exo相比,MCF-7/ADR細(xì)胞和ADR/ex

11、o中的miR-222-5p,miR-17-5p,miR-34a-5p,miR-let-7a,表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05),細(xì)胞內(nèi)miR-21-5p,miR-125b-5p和外泌體內(nèi)miR-342-3p沒有顯著性差異。其中,miR-34a-5p在MCF-7/ADR細(xì)胞中表達(dá)顯著降低,而在ADR/exo中表達(dá)顯著升高。
  2.通過軟件預(yù)測(cè),得到4個(gè)與乳腺癌耐藥性相關(guān)的,可與miR-34a-5p結(jié)合的靶基因:NOTCH1、HD

12、AC1、mTOR、HDAC7。qRT-PCR結(jié)果顯示,與MCF-7細(xì)胞和MCF-7/exo相比,MCF-7/ADR細(xì)胞和ADR/exo中靶基因在mRNA水平上均有顯著性差異(P<0.05)。NOTCH1、HDAC1、mTOR、HDAC7,在細(xì)胞中的表達(dá)為1.85±0.012,1.23±0.031,2.37±0.064,2.07±0.082;在外泌體中的表達(dá)為0.14±0.007,0.07±0.019,mTOR、HDAC7在外泌體中未表達(dá)

13、。
  3.qRT-PCR結(jié)果顯示,將miR-34a-5p mimic轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞后, MCF-7/ADR細(xì)胞及其外泌體中miR-34a-5p和NOTCH1的表達(dá)水平,與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。mi-34a-5p在MCF-7/ADR細(xì)胞和其外泌體中的表達(dá)分別為54.1±0.031,1.23±0.063;NOTCH1的表達(dá)分別為0.51±0.017,4.72±0.089。Western blot結(jié)果顯示

14、,將miR-34a-5p mimic轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞后,靶蛋白NOTCH1的表達(dá)明顯下調(diào),具有顯著性差異(P<0.05)。
  4.MTT結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比, MCF-7/ADR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimic后,對(duì)阿霉素的耐藥性下調(diào),具有顯著性差異(P<0.05)。
  結(jié)論:
  1.miR-34a-5p參與調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞MCF-7對(duì)阿霉素的耐藥過程,而NOTCH1基因可能是其調(diào)控的靶基因

15、之一。
  2.轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimic能夠有效上調(diào)miR-34a-5p在乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR中的表達(dá),同時(shí)引起NOTCH1蛋白在細(xì)胞的表達(dá)顯著下降,并且能夠提高細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。
  3.與MCF-7細(xì)胞相比,miR-34a-5p在MCF-7/ADR細(xì)胞中表達(dá)顯著降低,而在ADR/exo中表達(dá)顯著升高,提示細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生,部分原因可能是因?yàn)槟退幖?xì)胞中miR-34a-5p可以被外泌體包裹并排出細(xì)胞外

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