晚期糖基化終產(chǎn)物通過Akt-eNOS途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能研究.pdf

1、[研究背景及目的] 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,即能分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞,又稱血管母細(xì)胞(angioblast)或血管內(nèi)皮干細(xì)胞(endothelial stem cells)。1997年由Asahara等首次分離,并證實人類出生后的外周血循環(huán)中存在有能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的EPCs,它在機體的血管新生和內(nèi)皮損傷修復(fù)中起重要作用。近年來的研究表明EPCs在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色,外周血EP

2、Cs數(shù)量減少、功能障礙預(yù)示血管內(nèi)皮修復(fù)能力降低,心血管疾病發(fā)生率增高。 糖尿病是冠心病的等危癥,在糖尿病患者中,動脈粥樣硬化(AS)等慢性血管并發(fā)癥已成為主要致殘和致死原因。研究表明糖尿病患者外周血中EPCs數(shù)量較正常人減少,進一步研究表明晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)在糖尿病致動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。因此體外研究AGEs對EPCs的影響也有同樣的意義。先前的工作研究了AGEs通過p38MAPK途徑影響EPCs的功

3、能,本研究繼續(xù)探討AGEs是否也通過P13K/AM/eNOS通路調(diào)節(jié)EPCs的功能。 通心絡(luò)是依據(jù)中藥絡(luò)病理論研制的具有益氣活血、通絡(luò)止痛,使氣旺血行、脈絡(luò)暢通功效的中成藥物。已有研究證實通心絡(luò)能顯著改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能,延緩AS進程,改善冠心病心絞痛癥狀,我們研究通心絡(luò)對該通路的影響,進一步探討通心絡(luò)的作用機制。 [實驗方法] 一、人外周血EPCs的培養(yǎng)及鑒定 取健康成人自愿者外周血,用密度梯度離

4、心法分離出單個核細(xì)胞,將其接種于預(yù)先包被有人纖連蛋白六孔板培養(yǎng)皿中,含rh-VEGF、rh-bFGF、10％的胎牛血清M199培養(yǎng)液培養(yǎng)4天,PBS洗掉非貼壁細(xì)胞,換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7天,繼續(xù)使用PBS浸洗掉非貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞通過激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和Dil-acDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs,并進一步通過流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志CD34、CD133、VEGFR-2的表達(dá)。 二、AGEs對EPCs

5、p-Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)的影響 第8天同步化處理,按不同濃度AGEs和預(yù)干預(yù)因素(抗RAGE中和抗體、羅格列酮、通心絡(luò))分組,采用Western-blot檢測Akt、p-Akt、p-eNOS蛋白的表達(dá)。用image-pro plus6.0軟件進行定量分析,將各組所得的灰度值p-Akt/Akt、p-eNOS/β-actin相比,再以空白組值為分母相比的百分比。研究不同濃度和預(yù)干預(yù)因素對P-Akt、P-eNOS蛋白表達(dá)的影響

6、三、AGEs和L-NAME、LY294002對EPCs功能影響第8天同步化處理,分空白對照、AGEs、RAGE中和抗體、羅格列酮、通心絡(luò)、SNP,L-NAME、LY294002組。Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移,CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、總NO試劑盒檢測NO生成、人VCAM-1ELISA試劑盒檢測VCAM-1表達(dá)的情況。 [實驗結(jié)果] 一、EPCs的培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)4天后,可見典

7、型細(xì)胞集落,7天后形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。用Dil-acLDL和FITC-UEA-I對細(xì)胞染色后,通過激光共聚焦顯微鏡鑒定,FITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。流式細(xì)胞儀示貼壁細(xì)胞表達(dá)CD133陽性率在0.855±0.050;VEGF-R2陽性率0.826±0.053;CD34陽性率0.823±0.072。 二、AGEs對EPCsAktP-Akt、P-eNOS蛋白表達(dá)的影響研究

8、 隨著AGEs濃度的增加各組EPCsAkt蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異,P-Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)減少,100μg/ml AGEs組p-Akt/Akt比值較空白對照組下降34.5％、p-eNOS/β-actin下降56.3％,200μg/ml AGEs組p-Akt/Akt比值較空白對照組下降66.7％、p-eNOS/β-actin下降84.3％,200μg/ml AGEs組加入抗RAGE中和抗體、羅格列酮、通心絡(luò)預(yù)干預(yù)后,P-Akt/A

9、kt比值分別較200μg/ml AGEs組上升56.2％、53.8％、30.7％；p-eNOS/β-actin比值分別較200μg/ml AGEs組上升55.1％、46.8％、25.6％。 三、AGEs對EPCs功能影響的研究 200μg/ml AGEs組可以顯著促進EPCs的凋亡,空白組為4.6％,AGEs組為15.2％,L-NAME和LY294002分別為16％和16.9％,AGEs組加入SNP、抗RAGE中和抗體、

10、羅格列酮、通心絡(luò)預(yù)干預(yù)后凋亡率減少。AGEs也可增加VCAM-1的表達(dá),降低EPCs遷移、黏附、增殖、NO生成能力。 [結(jié)論] 一、采用密度梯度離心法可成功從人外周血中分離和培養(yǎng)血管EPCs。 二、AGE-HSA促進EPCs的凋亡,抑制EPCs的增殖,并促進其分泌VCAM-1,降低EPCs遷移、黏附、增殖、NO生成能力。 三、AGEs可通過Akt/eNOS信號通路途徑影響EPCs的功能。 四、SN