胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素在呼吸道合胞病毒感染誘發(fā)哮喘加重中的作用研究.pdf

1、研究背景及意義： 支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種嚴重危害人類健康的慢性呼吸道疾病，以氣道慢性炎癥、粘液分泌增加、氣道反應性增高及氣道重塑為主要特征。哮喘的發(fā)生與發(fā)展受多種因素的調(diào)控，從而決定了淋巴細胞分化，免疫反應類型，細胞因子合成及組織修復過程。盡管哮喘基礎研究取得較大的進步，但目前臨床上對于哮喘的急性加重以及重癥哮喘的治療仍然不是很滿意。隨著分子病毒學技術(shù)的發(fā)展和RT-PCR技術(shù)在臨床研究中的應用，呼吸道病毒感染作為哮喘加重的

2、最重要原因已被廣泛認識。已經(jīng)證實，病毒誘發(fā)的哮喘加重在學齡兒童中的比例約為80%-85%，而在成人中約為60%-75%。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）作為呼吸道單鏈RNA病毒的一種，是引起小兒呼吸道感染的最常見病原體，也是誘發(fā)嬰幼兒哮喘的主要原因，在哮喘的發(fā)展和加重中被認為是一個重要的危險因子。而且，針對RSV的免疫是不完全的和暫時的，所以已經(jīng)感染過RSV的成人可以再次被同株的RSV感染

3、。 微生物感染對機體的破壞作用導致宿主防御機制的進化。在哺乳動物，有兩套防御機制：固有免疫和繼發(fā)性免疫。固有免疫識別是通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）來完成的，每個受體都對微生物的保守和不變的特征識別具有廣泛的特殊性。PRRs識別微生物是通過與病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的結(jié)合來完成的。在PR

4、Rs的病毒識別中，最具特征性的是Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）。 呼吸道上皮細胞除了作為物理屏障，也能通過感受外界刺激因素啟動固有免疫反應產(chǎn)生細胞因子，從而影響繼發(fā)性免疫反應。在針對吸入性外來變應原和病原體的繼發(fā)性免疫反應的起始中，局部浸潤的樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）起到關(guān)鍵性作用。氣道上皮細胞影響DCs可以通過DCs激活因子胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymic st

5、romal lymphopoietin，TSLP）的產(chǎn)生來調(diào)控Th細胞的局部分化。研究證實TSLP能誘導DCs調(diào)節(jié)初始CD4+T淋巴細胞向Th2細胞分化，產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α等細胞因子。在對氣道上皮細胞生成TSLP的刺激因子的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR3的配體雙鏈RNA （dsRNA）與TLR3受體結(jié)合產(chǎn)生大量的TSLP mRNA。這提示病毒在呼吸道上皮細胞內(nèi)復制過程中形成的dsRNA中間體，可能通過TSLP的誘導，加

6、重Th2炎癥反應，從而進一步加重哮喘患者氣道粘膜炎癥。這個推論可以解釋為什么呼吸道病毒感染加重變態(tài)反應性炎癥，而從免疫學理論上講，病毒誘導的Th1免疫反應能拮抗Th2調(diào)節(jié)的炎癥反應。本項研究主要通過研究RSV感染人支氣管上皮細胞16HBE分析固有免疫反應受體TLR3的表達情況及對TSLP生成的影響，通過TLR3抗體阻斷的方法研究是否可以引起TSLP的生成的改變，通過模擬氣道局部Th1和Th2內(nèi)環(huán)境加入IFN-γ和IL-4觀察其對RSV感

7、染誘發(fā)的TSLP生成影響，同時觀察利巴韋林和地塞米松等藥物干預對支氣管上皮細胞生成TSLP的影響。為明確TSLP在哮喘動物體內(nèi)的變化與哮喘的關(guān)系，通過RSV感染小鼠哮喘加重模型進一步分析在RSV感染情況下小鼠氣道局部TSLP的表達與小鼠肺部炎癥的相互關(guān)系，并觀察不同藥物治療對RSV感染哮喘加重小鼠氣道TSLP生成和肺部炎癥的影響。 方法： 一、體外細胞學試驗。 1.不同濃度和不同時間人工合成dsRNA聚肌胞（Po

8、ly I：C）對人支氣管上皮細胞16HBE表達TSLP mRNA和TLR3 mRNA的影響。 分別加入含0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml聚肌胞的10%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE細胞，刺激3小時，實時熒光定量RT-PCR檢測TSLP mRNA和TLR3 mRNA相對表達量。 10μg/ml聚肌胞加入10%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE細胞，分別刺激1h、2h、3h、6

9、h、12 h、24 h，實時熒光定量RT-PCR檢測TSLP mRNA和TLR3 mRNA相對表達量。 2.RSV病毒感染對人支氣管上皮細胞16HBE固有免疫受體TLR3表達的影響。 RSV病毒感染Hep-2細胞進行病毒擴增；RSV在Hep-2細胞質(zhì)內(nèi)擴增的間接免疫熒光鑒定； Reed-Muench法測算RSV細胞毒力。RSV感染人支氣管上皮細胞16HBE 24小時，間接免疫熒光檢測細胞TLR3受體表達變化。

10、3.RSV病毒感染及干預因素對16HBE細胞TSLP mRNA和TLR 3mRNA表達水平和TSLP蛋白表達的影響。 試驗分6組：對照組，RSV組，RSV/Anti-TLR3組，RSV/IFN-γ組，RSV/IL-4組，RSV/地塞米松組；RSV感染6小時后實時熒光定量RT-PCR檢測細胞TSLP mRNA和TLR3 mRNA相對表達量；RSV感染24小時后western blotting檢測各組細胞TSLP蛋白表達水平。

11、 4.利巴韋林抑制RSV病毒感染對16HBE細胞TSLP mRNA表達水平和TSLP蛋白表達的影響。 試驗分4組：對照組，RSV組，RSV/利巴韋林組，利巴韋林組；RSV感染6小時后實時熒光定量RT-PCR檢測細胞TSLP mRNA相對表達量；RSV感染24小時后western blotting檢測各組細胞TSLP蛋白表達水平。 二、動物實驗。 1.RSV病毒感染對哮喘加重小鼠氣道TSLP分泌和肺部炎癥的影響

12、 32只BALB/c小鼠分為4組：A組（對照組），B組（OVA組），C組（RSV組），D組（OVA/RSV模型組）。 無創(chuàng)肺功能檢測小鼠氣道反應性：不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)，BUXCO無創(chuàng)肺功能檢測儀檢測Penh值。 小鼠血清ELISA法檢測細胞因子：小鼠血清用于IL-4、IFN-γ、IL-5、IL-13細胞因子檢測。 小鼠氣管灌洗液細胞分類計數(shù)和ELISA檢測TSLP：聚乙烯導管行小鼠氣管插管，PBS灌洗，

13、灌洗液上清ELISA法檢測細胞因子TSLP；灌洗液離心沉淀細胞計數(shù)，瑞氏-吉姆薩染色細胞分類計數(shù)。 小鼠肺臟組織病理觀察：蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠肺臟病理變化；碘酸雪夫（PAS）染色觀察氣道上皮細胞粘液合成。 小鼠肺臟組織免疫組化觀察氣道上皮細胞TSLP表達，DAB顯色，陽性顯示棕黃色。 小鼠肺臟組織TSLP蛋白western blotting檢測，Gel-Pro ANALYZER4.5軟件分析TSLP的

14、相對表達量。 2.不同藥物治療對RSV感染哮喘加重小鼠TSLP分泌和肺部炎癥的作用 32只BALB/c小鼠分為4組：對照組（OVA/RSV組），聚肌胞組（OVA/RSV/Poly I：C組），利巴韋林組（OVA/RSV/Rib組），地塞米松組（OVA/RSV/Dex組）。 無創(chuàng)肺功能檢測小鼠氣道反應性；小鼠血清ELISA法檢測細胞因子血清IL-4、IFN-γ、IL-5、IL-13濃度；小鼠氣管灌洗液細胞分類計數(shù)和

15、ELISA檢測氣管灌洗液TSLP濃度；小鼠肺臟組織病理觀察；小鼠肺臟組織免疫組化觀察TSLP表達；小鼠肺臟組織TSLP蛋白western blotting檢測。（方法同上）。 三、統(tǒng)計學處理。 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。各組間多重比較采用單向方差分析（one-way ANOVA），方差齊性時采用LSD法和SNK法檢驗，方差不齊時采用Dunnett' s T3法檢驗。以P<

16、0.05為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1.dsRNA可以激活人支氣管上皮細胞16HBE固有免疫受體TLR3，促進TSLPmRNA表達量增加。 2.RSV感染后病毒復制促進固有免疫受體TLR3在人支氣管上皮細胞16HBE內(nèi)的表達。 3.RSV感染促進16HBE細胞表達TSLP；IFN-γ可起到抑制作用，IL-4則起到協(xié)同作用促進TSLP表達，表明不同Th1/Th2微環(huán)境對TSLP的表達有不同影響；TLR3受體阻

17、斷可以適度抑制TSLP表達，間接表明固有免疫受體TLR3在RSV感染的TSLP表達中起到一定作用；地塞米松可以顯著降低RSV感染引起的TSLP表達，說明糖皮質(zhì)激素在RSV感染引起的TSLP表達中起到抑制作用。 4.利巴韋林抗病毒治療可以有效抑制16HBE細胞表達TSLP，說明抑制RSV在細胞內(nèi)復制可以起到減少細胞表達TSLP的作用。 5.RSV感染可以促進OVA過敏性哮喘小鼠氣道上皮細胞生成TSLP增加，并加重肺部炎癥反