靶向c-fos與junB RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、本論文研究?jī)?nèi)容分為兩個(gè)部分。
　　 第一部分：藥物成癮性是由于長(zhǎng)期藥物濫用導(dǎo)致的一種復(fù)雜的大腦疾病，現(xiàn)已成為全世界關(guān)心的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題，其主要特征是一旦成癮，將經(jīng)久不衰，很難消失。關(guān)于藥物的精神依賴至今尚無(wú)理想的根治方法，本研究根據(jù)即刻早期基因c-fos，junB與藥物成癮的密切關(guān)系，深入探討c-fos與junB基因?qū)λ幬锍砂a作用的影響，進(jìn)而尋求解決藥物精神依賴的有效基因療法。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要采用RNAi技術(shù)，應(yīng)用RN

2、A聚合酶Ⅲ中的U6啟動(dòng)子成功構(gòu)建了靶向c-fos與junB基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pKB-GU-shC，pKB-GU-shB以及陰性對(duì)照載體pKB-GU。采用Exgen500轉(zhuǎn)染試劑法將各重組干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，考察細(xì)胞接種數(shù)目，細(xì)胞融合度，N/P及血清等因素優(yōu)化得到最佳瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率為50％左右。進(jìn)一步將載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-fos與junB基因的表達(dá)情況；同時(shí)我們對(duì)轉(zhuǎn)染單基

3、因沉默載體的PC12細(xì)胞在G418抗性篩選壓力下進(jìn)行穩(wěn)定篩選，2周左右得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，對(duì)其進(jìn)行了RT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞中c-fos與junB的mRNA相對(duì)表達(dá)量與無(wú)干擾質(zhì)粒pKB-GU組無(wú)明顯差別。穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒pKB-GU-shC，pKB-GU-shB的PC12細(xì)胞中c-fos與junB的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為51％和49.73％。
　　 本研究通過(guò)基因重組技術(shù)，分別成功構(gòu)建

4、了靶向c-fos與junBRNAi載體并成功篩選出不同干擾質(zhì)粒的抗性克?。煌ㄟ^(guò)RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)出上述干擾序列可以有效地抑制PC12細(xì)胞c-fos與junB的表達(dá)，為進(jìn)一步在整體水平中研究c-fos及junB基因的功能提供了新的研究方法，在某種程度上為藥物成癮的分子機(jī)制研究提供了一個(gè)較好的體外細(xì)胞模型。
　　 第二部分：腫瘤的發(fā)病機(jī)制涉及到多個(gè)信號(hào)通路，它們相互聯(lián)系、相互作用，組成一個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)體系，因此針對(duì)單個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行抗腫瘤

5、治療很有可能收效甚微。為了說(shuō)明腫瘤多靶點(diǎn)治療的重要意義，將同時(shí)靶向hEGFR和hTERT不同序列的16個(gè)pRS-G-T系列的雙基因RNA干擾表達(dá)載體以及分別靶向hEGFR，hTERT的8個(gè)單基因RNA干擾載體及陰性對(duì)照質(zhì)粒pRS采用Exgen500轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞SMMC-7721，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示雙基因RNAi載體pRS-shG4-T4和pRS-shG3-T4對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率均可達(dá)到40％左右。將對(duì)肝癌細(xì)胞

6、SMMC-7721生長(zhǎng)抑制效率最好的重組載體pRS-G4-T4，pRS-G3-T4以及在單基因RNAi中篩選出抑制基因表達(dá)效果最好的shRNA，組成的雙基因載體pRS-G2-T2分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，48h后RT-PCR檢測(cè)到細(xì)胞中的hEGFRmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.9，0.843，0.538；hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.679，0.74，0.32。腫瘤的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)疾病，為了進(jìn)一步揭示腫瘤發(fā)病機(jī)制