駱駝源和竹鼠源隱孢子蟲的分離鑒定及種系發(fā)育分析.pdf

1、隱孢子蟲是一種危害嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，它主要造成宿主不同程度的腹瀉，其寄生范圍很廣，能感染包括人在內(nèi)的260多種脊椎動(dòng)物。研究發(fā)現(xiàn)，野生動(dòng)物是隱孢子蟲重要儲(chǔ)存宿主，目前研究人員已在不同種類的野生動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)蟲種。本實(shí)驗(yàn)嘗試采用飽和蔗糖漂浮法，從兩個(gè)黑熊養(yǎng)殖場(chǎng)、成都動(dòng)物園、碧峰峽野生動(dòng)物園、貴陽動(dòng)物園、竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)的野生動(dòng)物和從成都及雅安地區(qū)的大熊貓采集到的共1370份糞便樣品中分離隱孢子蟲;結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子方法對(duì)其進(jìn)行蟲種鑒定，再

2、分別采用MLST技術(shù)和gp60位點(diǎn)進(jìn)行亞型鑒定;并對(duì)各基因位點(diǎn)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行同源性分析和構(gòu)建進(jìn)化樹，研究卵囊所屬種類和基因分型地位。
　　結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)共分離得到一株駱駝源隱孢子蟲和三株竹鼠源隱孢子蟲。分離得到的駱駝源隱孢子蟲卵囊在飽和蔗糖溶液中呈現(xiàn)淡紫色，殘留體透明卵囊呈圓形或卵圓形。400×光鏡下平均每個(gè)視野可觀察到3個(gè)卵囊，測(cè)量50個(gè)卵囊其平均大小為7.03(5.87～7.95)×5.50(4.60～6.00)μm(n

3、=50)。運(yùn)用巢式PCR擴(kuò)增出駱駝源隱孢子蟲SCBC02分離株18SrRNA、COWP、CpA135三個(gè)基因位點(diǎn)序列，測(cè)序結(jié)果經(jīng)矯正后提交到Genbank獲得登錄號(hào)。序列同源性分析得出，該分離株在三個(gè)基因位點(diǎn)上均與Cryptosporidium andersoni參考序列同源性最高?；贜-J法構(gòu)建三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)化樹得出，SCBC02分離株均與Candersoni處于同一分支。最后我們結(jié)合鏡檢觀察和全部三個(gè)位點(diǎn)序列系統(tǒng)發(fā)育分析判斷該分離株屬

4、于安氏隱孢子蟲。利用MLST(multilocussequence typing)方法對(duì)其亞型進(jìn)行鑒定，MS1、MS2、MS3、MS16位點(diǎn)亞型鑒定結(jié)果分別為A4、A4、A4、A1，與四川地區(qū)奶牛常見隱孢子蟲亞型相同。我們推斷，駱駝與奶牛之間可能存在隱孢子蟲相互傳播。將卵囊口服接種至免疫抑制狀態(tài)下的昆明系鼠、SD大鼠和倉鼠，并連續(xù)30 d對(duì)這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞便進(jìn)行隱孢子蟲卵囊檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)蟲卵，顯示感染不成功。
　　從竹鼠分離得到三

5、株隱孢子蟲(YA01、YA02、YA03)，形態(tài)相似，在飽和蔗糖溶液中呈現(xiàn)淡紫色，殘留體透明卵囊呈圓形或卵圓形。將擴(kuò)增出的18S rRNA、COWP、CpA135、HSP70、actin位點(diǎn)序列矯正后提交到Genbank并獲得登錄號(hào)。經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)，在18S rRNA位點(diǎn)YA01、 YA02、YA03之間沒有差異，全部與Cryptosporidium parvum有100％同源性;COWP位點(diǎn)YA03與YA01和YA02有0.3％的差

6、異，YA01、YA02間沒有差異，但都與C.parvum同源性最高;HSP70位點(diǎn)YA01、YA03之間沒有差異，YA02與另外兩株之間存在0.2％的差異;actin位點(diǎn)克隆后測(cè)序，分析得出，YA01、YA02、 YA03之間均有差異，與C.parvum參考序列同源性分別為99.7％、99.2％、99.4％; CpA135位點(diǎn)YA01與YA02相同，它們與YA03同源性為99.3％。構(gòu)建進(jìn)化樹觀察到，三株竹鼠源隱孢子蟲在所有位點(diǎn)均與C.

7、parvum處于同一分支。綜合形態(tài)學(xué)和分子分型，我們鑒定三株隱孢子蟲均為微小隱孢子蟲。利用gp60位點(diǎn)對(duì)三株隱孢子蟲亞型鑒定并命名為ⅡpA9、ⅡpA9、ⅡoA13G1，其中YA01(ⅡpA9)、YA02(ⅡpA9)為新的亞型。
　　綜上所述，本試驗(yàn)是四川地區(qū)首次檢測(cè)到駱駝感染隱孢子蟲，關(guān)于駱駝源隱孢子蟲開展的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，豐富了我國(guó)駱駝人獸共患寄生蟲病研究工作;本實(shí)驗(yàn)同時(shí)也是世界上首次分離得到三株竹鼠源隱孢子蟲，填補(bǔ)了竹鼠隱孢子蟲病研