GAP-43腺相關(guān)病毒的制備及其在大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá).pdf

1、福建醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文GAP-43腺相關(guān)病毒的制備及其在大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)姓名：陳國智申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：眼科學(xué)（青光眼）指導(dǎo)教師：朱益華;徐國興20080401G A P ．4 3 腺相關(guān)病毒的制備及其在大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)摘要目的：構(gòu)建攜帶生長相關(guān)蛋8 4 3 ( G A P 一4 3 ) 基因的重組腺相關(guān)病毒，測定其感染滴度，并注射大鼠玻璃體腔，觀察其感染視網(wǎng)膜組織后的表達(dá)情況。探討通過腺相關(guān)病毒介導(dǎo)G A P 一4 3 基因

2、治療視神經(jīng)及視網(wǎng)膜病變的可行性。方法：克隆目的基因G A P 一4 3 片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒p A A V —I R E S —h r G F P —G A P 一4 3 。利用磷酸鈣法將D A A V —I R E S —h r G F P —G A P 一4 3 、p A A V —R C 和p H e l p e r 共轉(zhuǎn)染A A V 一2 9 3 細(xì)胞，構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒( r A A V —G A P 一4 3 ) ，經(jīng)“氯仿一

3、P E G 8 0 0 0 ／N a C 卜氯仿”的方法純化、濃縮，感染H T l 0 8 0 細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞數(shù)，測定病毒滴度。大鼠玻璃體腔內(nèi)注射r A A V —G A P 一4 3 ，4 w后眼球冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，w e s t e r nb l o t 檢測視網(wǎng)膜組織中G A P 一4 3 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：成功構(gòu)建了p A A V —I R E S —h r G F P ' - G

4、A P 一4 3 重組質(zhì)粒；包裝制備- f G A P 一4 3 腺相關(guān)病毒( r A A V —G A P 一4 3 ) ，經(jīng)純化、濃縮后病毒滴度為3 ．0 ×1 0 9 ／m l 。r A A V —G A P 一4 3注射大鼠玻璃體腔4 w 后，視網(wǎng)膜冰凍切片，熒光顯微鏡下可見到熒光表達(dá)，w e s t e r n b l o t 分析顯示視網(wǎng)膜組織高表達(dá)G A P 一4 3 蛋白。結(jié)論：構(gòu)建的r A A V —G A