酸酐修飾人血清白蛋白的抗病毒活性及安全性研究.pdf

1、自1981年第一例HIV/AIDS感染病例在美國被報道以來，艾滋病迅速地在全世界范圍內(nèi)蔓延。理論上，HIV感染最好的預(yù)防手段是研發(fā)艾滋病疫苗。然而，目前仍沒有一個艾滋病疫苗被臨床試驗(yàn)證明為有效。目前，治療HIV主要手段是使用各種抗病毒藥物。目前臨床批準(zhǔn)的抗艾滋病藥物已經(jīng)有29種，但絕大部分針對病毒編碼的兩種酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶。盡管有這么多的抗HIV藥物，但它們?nèi)匀徊荒芮宄鼿IV，只能抑制病毒的復(fù)制，將病毒載量降低，一定程度地恢復(fù)患者

2、的免疫功能，延長患者的生命。直到2003年，第一個HIV進(jìn)入抑制劑衍生于病毒包膜蛋白gp41的多肽恩夫韋特(T-20)被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，開創(chuàng)了病毒進(jìn)入抑制劑作為抗病毒藥物的新時代。HIV進(jìn)入抑制劑雖然能從源頭上阻止病毒的入侵，但其僅能特異性地抑制HIV-1，對HIV-2沒有抑制活性，同時多肽類藥物價格昂貴，也限制了它們的臨床應(yīng)用。另一棘手的問題是HIV病毒變異性極高，極易產(chǎn)生耐藥株，從而使現(xiàn)有的許多抗病毒藥物失活。聯(lián)合3種或4種抗病

3、毒藥物（通常包含一種蛋白酶抑制劑）的高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法(HAART)目前已成為治療HIV感染的標(biāo)準(zhǔn)方法，其可以顯著降低HIV感染患者的死亡率和發(fā)病率。HAART通常被稱為“雞尾酒療法”(Cocktail therapy)。不同作用機(jī)制的抗病毒藥物之間的相互作用及合理搭配使HAART的效果比單一用藥有優(yōu)勢，能有效地降低用藥劑量，減少不良反應(yīng)，提高抗病毒譜，更為重要的是能減少耐藥病毒株的產(chǎn)生。因此，急需尋找新的來源的藥物抑制HIV的

4、廣泛傳播。
　　 人血清白蛋白(HSA)是人血漿中的最為主要的蛋白質(zhì)，其具有許多重要的生理學(xué)和藥理學(xué)功能，目前已經(jīng)成為基礎(chǔ)及臨床研究最廣泛的目標(biāo)蛋白之一。尤其是對HSA進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，利用化學(xué)修飾產(chǎn)物作為理想的治療分子進(jìn)行研發(fā)，已經(jīng)成為生命科學(xué)中重要的研究手段之一。HSA其非糖基化的單鏈多肽包含585個氨基酸，相對分子量為66.5 kD，主要是由18種氨基酸殘基組成，其中堿性氨基酸賴氨酸有59個，精氨酸則有27個。由于酸酐是

5、強(qiáng)酸性物質(zhì)，而蛋白質(zhì)末端含有很多堿性的氨基酸，因此兩者發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時，其蛋白質(zhì)末端的堿性氨基酸殘基必然會被酸酐所修飾。如果將蛋白末端的這些堿性氨基酸，選用適合的酸酐進(jìn)行化學(xué)修飾，將得到一類新的物質(zhì)，即酸酐修飾的HSA。1995年，美國紐約血液中心的Neurath AR和姜世勃等人的研究發(fā)現(xiàn)3-羥基-鄰苯二甲酸酐(3-HP)修飾的β-乳球蛋白(β-LG)，即3-HP-β-LG，可特異性抑制HIV的感染。未經(jīng)修飾的β-乳球蛋白及3-HP本身

6、都無抑制HIV的活性，說明酸酐修飾使無活性的蛋白產(chǎn)生了抗HIV活性[1，2]。然而由于時逢全球瘋牛病爆發(fā)，使得來源于牛奶蛋白的制劑3HP-β-LG的研發(fā)受到了極大的影響，將其研發(fā)的試驗(yàn)研究被迫終止。
　　 HSA是人血液中最為主要的一種蛋白質(zhì)，其含量占血漿中總蛋白含量的60％以上，因此含量豐富。而且結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，在人血管和血管外循環(huán)中分布較廣，半衰期長達(dá)19 d，無明顯的免疫原性，是血液中重要的物質(zhì)輸送載體，因此將其做為抗病毒藥

7、物研發(fā)具有一定的優(yōu)勢。因此，本文采用類似的方法，選用人血清白蛋白作為被修飾蛋白，來研究酸酐修飾人血清白蛋白特性和評價其抗病毒活性及其可能的臨床應(yīng)用。
　　 1.酸酐修飾人血清白蛋白HP-HSA的制備和條件優(yōu)化
　　 本文參考文獻(xiàn)方法，選用3-羥基-鄰苯二甲酸酐HP來修飾人血清白蛋白HSA，為優(yōu)化HP-HSA的制備條件，我們選用不同濃度的HP(20 mM、40 mM及60 mM)和不同的pH值反應(yīng)體系（pH7.0、8.0及

8、9.0），合成了的一系列不同的HP-HSA，并評價這些HP-HSA的抗兩種HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒株（X4及R5型）的活性。同時，還通過檢測不同條件下合成的HP-HSA期蛋白末端堿性氨基酸（主要包括賴氨酸及精氨酸）殘基被HP修飾比率，比較HP-HSA的抗病毒活性與蛋白末端堿性氨基酸被修飾比率之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSA蛋白末端的堿性氨基酸殘基大部分能被HP所修飾，其蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而將無活性的HSA轉(zhuǎn)變成具有較

9、強(qiáng)抗HIV-1活性的病毒抑制劑HP-HSA。HP-HSA中賴氨酸和精氨酸殘基的被修飾的比率越高，其抗抗HIV-1 X4型(HIV-1ⅢB)及R5型(HIV-1Bal)的病毒株的作用也相應(yīng)的越強(qiáng)，說明蛋白末端堿性氨基酸被修飾的比率與HP-HSA抗病毒活性密切呈正相關(guān)，修飾蛋白末端的堿性氨基酸殘基被相應(yīng)酸酐修飾的比率與酸酐修飾蛋白的抗病毒活性密切相關(guān)。通過比較分析確定，HP-HSA化學(xué)修飾的最優(yōu)合成條件為，酸酐HP終濃度60 mM，pH值為

10、9.0，在這一條件下，HP-HSA的蛋白末端賴氨酸被修飾的比率為98.17％，而精氨酸被修飾的比率為91.67％。而在這一條件下，合成的HP-HSA的抗HIV-1ⅢB（X4型）和BaL（R5型）病毒的IC50值分別是0.851 nM和1.454 nM。
　　 2.HP-HSA抗病毒活性研究
　　 作為一個理想的防治性傳播性疾病的抗病毒制劑，首先要保證其具有廣譜性和有效性，即能夠高效抑制絕大部分與性傳播疾病有關(guān)的病原體的感

11、染。與3HP-β-LG相類似，酸酐修飾蛋白HP-HSA也具有廣譜高效的抗病毒活性，其能抑制多種HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒株包括HIV-1 X4型和R5型，IC50在低納摩爾水平。
　　 另外，HP-HSA也能有效抑制HIV-2感染，意味著HP-HSA也能被用于HIV-2病毒廣泛流行的西非等國家[3]。同時HP-HSA還能抑制SIV的感染[4]。由于SIV病毒能夠感染恒河猴，因此利用SIV病毒陰道攻擊恒河猴的動物模型，可先期評價HP-H

12、SA在動物體內(nèi)的抗病毒活性。
　　 目前大多數(shù)的抗病毒藥物，尤其是臨床上應(yīng)用最為廣泛的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑臨床應(yīng)用的局限性最主要的是由于HIV病毒耐藥株的產(chǎn)生。HIV病毒需寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)，利用宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)生存、增殖，并保持極強(qiáng)的生命力。HIV病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)不斷復(fù)制，但是其復(fù)制的錯配率極高且極易產(chǎn)生高變異性，這也是目前理想抗HIV病毒藥物研發(fā)緩慢的主要原因之一。本文研究發(fā)現(xiàn)，HP-HSA對幾類常見的抗病毒藥物包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶

13、抑制劑AZT，非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑A17及HIV進(jìn)入抑制劑T20的耐藥病毒株，均具有非常好的抑制作用，其IC50值均在低納摩爾水平，與抗HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒分離株的抗性相當(dāng)。這彌補(bǔ)了這些目前臨床應(yīng)用的主要的抗病毒藥物的不足，從而使其具備了被進(jìn)一步開發(fā)的前景。如果將這類蛋白類藥物與抗病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用，可能也將成為抗病毒藥物研究的一個新的方向。
　　 如前所述，生殖器單純皰疹病毒Ⅱ型（HSV-2）是另一類導(dǎo)致性傳播性疾病STD的主要

14、病原體，約75％生殖器皰疹病例是由HSV-2引起的，它是引發(fā)生殖器皰疹和潰瘍最主要的原因，是一個世界性的公共衛(wèi)生問題。值得注意的是，其引發(fā)的生殖器皰疹據(jù)報道與HIV感染的關(guān)系極為密切，研究發(fā)現(xiàn)患有生殖器皰疹的病人更容易感染HIV，其HIV感染率可增加2～4倍。因此，有效控制HSV-2感染對減少HIV的流行具有直接的作用。如果抗病毒藥物在具有抗HIV活性的同時，具有抑制HSV-2病毒的作用，則將大大增加該抗病毒藥物的抗HIV活性，從而成為

15、高效雙功能的抗病毒制劑。目前，臨床應(yīng)用的大部分抗HIV藥物均為窄譜抗病毒藥物，其無或者對HSV-2的抑制作用不強(qiáng)。本文我們研究發(fā)現(xiàn)，酸酐修飾人血清白蛋白HP-HSA對HSV-2病毒有明顯抑制作用。
　　 3.HP-HSA抗病毒作用機(jī)制研究
　　 HIV病毒進(jìn)入CD+4靶細(xì)胞一般是在1h內(nèi)完成的。如果一種藥物為HIV進(jìn)入抑制劑，其必須在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞前與病毒或靶細(xì)胞接觸。因此，選用time-of-addition的分析方式

16、，在病毒感染靶細(xì)胞的不同階段加入酸酐修飾蛋白，以觀察HP-HSA到底作用在HIV感染的哪個環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HP-HSA在病毒感染2h后加入時，其抗HIV-1ⅢB和抗HIV-1BaL病毒活性完全消失，其作用與FDA批準(zhǔn)的三種HIV進(jìn)入抑制劑如T20，AMD3100（CXCR4輔助受體抑制劑）及Maraviric（CCR5輔助受體抑制劑）藥物的失活時間相似，而對照藥物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT，即使在病毒感染靶細(xì)胞8h后加入，仍然能保持較高

17、的抗HIV-1活性。這些結(jié)果說明HP-HSA是一類特異性的HIV進(jìn)入抑制劑，對HIV病毒復(fù)制的其他環(huán)節(jié)無明顯作用。
　　 由于阻斷HIV病毒生命周期的第一個階段，因此靶向HIV進(jìn)入階段的抗病毒藥物均具有明顯的優(yōu)勢[5]。研究表明，游離病毒和已感染HIV的靶細(xì)胞都能感染新的靶細(xì)胞，而后者在HIV的感染中占主要地位[6]。在HIV的感染過程中，首先是HIV包膜與靶細(xì)胞膜發(fā)生融合，HIV基因組進(jìn)入靶細(xì)胞。HIV進(jìn)入靶細(xì)胞是由病毒表面的

18、包膜糖蛋白介導(dǎo)的。因此，阻止HIV病毒的進(jìn)入，關(guān)鍵是阻止HIV Env誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合及病毒-細(xì)胞融合過程。通過細(xì)胞-細(xì)胞融合、病毒-細(xì)胞融合及細(xì)胞間的傳播等實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，HP-HSA的確作用于病毒的進(jìn)入階段，是一類HIV進(jìn)入/融合抑制劑。
　　 HIV通過三個步驟進(jìn)入宿主細(xì)胞:1）HIV顆粒通過其包膜上的糖蛋白gp120與靶細(xì)胞表面的CD4受體粘附;2）gp120發(fā)生構(gòu)象改變以適應(yīng)與靶細(xì)胞上的輔助受體CCR5或CXCR

19、4結(jié)合;3）HIV跨膜蛋白亞基gp41介導(dǎo)病毒包膜與靶細(xì)胞膜發(fā)生融合。那么HP-HSA到底作用于HIV進(jìn)入的哪個環(huán)節(jié)，則成了下一步關(guān)心的問題，因此我們對HP-HSA的作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究。
　　 HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的第一步就是HIV病毒顆粒通過其包膜糖蛋白gp120與靶細(xì)胞表面的CD4受體粘附，因此，我們首先檢測HP-HSA是否抑制gp120和可溶性CD4分子(sCD4)的體外結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HP-HSA能抑制來源于HIV-1ⅢB和H

20、IV-1BaL的gp120與sCD4的結(jié)合，而未修飾HSA則無抑制作用。這些結(jié)果表明，HP-HSA可能是通過抑制病毒包膜糖蛋白gp120結(jié)合到靶細(xì)胞上的CD4受體而產(chǎn)生抑制作用的。ELISA和流式分析結(jié)果進(jìn)一步表明，HP-HSA可通過與病毒包膜糖蛋白gp120和靶細(xì)胞上的CD4受體結(jié)合，阻止HIV-1的gp120與CD4兩者的相互作用，從而產(chǎn)生抑制病毒與細(xì)胞膜融合的過程。HSA蛋白表面正電荷的精氨酸和賴氨酸殘基被酸酐修飾之后，其表面聚集

21、著大量的負(fù)電荷側(cè)鏈，這些負(fù)電荷側(cè)鏈能與gp120和CD4分子結(jié)合，從而產(chǎn)生抗病毒作用。
　　 4.HP-HSA的局部用藥安全性研究
　　 理想的抗病毒藥物除了具備上述價廉和高效等條件外，更為重要的一點(diǎn)即為其安全性?？共《舅幬镉捎诳赡苊咳毡欢啻问褂?，且長期甚至終生服用，因此必須不會導(dǎo)致組織損傷，不會產(chǎn)生過敏反應(yīng)，不會改變陰道內(nèi)酸性環(huán)境，不會造成陰道內(nèi)菌群失調(diào)，同時，應(yīng)無全身性毒副反應(yīng)。在體液中仍能保持較好的抗病毒活性。

22、r>　　 陰道粘膜是多層鱗狀上皮細(xì)胞，它們組成了防御外來病毒的一道物理屏障。因此，任何能破壞上皮組織完整性的因素，譬如物理損傷、性傳播病原體的感染、局部潰瘍及炎癥、激素水平失衡、陰道正常菌群失調(diào)、以及不當(dāng)使用陰道洗液等，都可能提高HIV的感染率。因此，藥物對陰道上皮細(xì)胞的毒性是其能否用于臨床的關(guān)鍵。我們首先評價了HP-HSA對3種T淋巴細(xì)胞和3種正常人陰道及子宮頸上皮細(xì)胞[7]的體外毒性，結(jié)果顯示，HP-HSA對測試的6種病毒作用T淋

23、巴靶細(xì)胞及正常人陰道及子宮頸組織細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用很低，其CC50的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其抑制HIV-1ⅢB病毒的IC50值，這意味著HP-HSA體外基本無毒。
　　 陰道乳酸菌是內(nèi)源性的殺微生物劑，它能通過產(chǎn)生乳酸和過氧化氫來發(fā)揮效能。流行病學(xué)研究表明產(chǎn)過氧化氫乳酸菌能有效降低HIV的感染率。其原因推測是間接的，產(chǎn)過氧化氫乳酸菌能降低細(xì)菌性陰道炎的發(fā)病率，而后者導(dǎo)致的陰道上皮組織損傷是HIV傳染的一個主要影響因素。因此，我們評估了HP-

24、HSA對17株正常人陰道乳酸桿菌生長的影響。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較高濃度的HP-HSA對陰道正常乳酸桿菌的生長無明顯影響，而陽性對照藥物氨芐青霉素對陰道乳酸桿菌各株均有明顯抑制作用，其MIC為0.313～1.25μg/ml。
　　 前面研究證實(shí)，HP-HSA的作用靶點(diǎn)之一為T淋巴細(xì)胞表面的CD4受體，而CD4+T淋巴細(xì)胞是人免疫系統(tǒng)中極為重要的一類細(xì)胞，對人正常免疫功能起著至關(guān)重要的作用[8]。那么，HP-HSA作為殺微生物劑用于

25、機(jī)體后，是否會對T淋巴細(xì)胞的正常的功能產(chǎn)生影響？首先，觀察了HP-HSA是否對正常人PBMCs增殖的影響，同時觀察了HP-HSA對PHA刺激的PBMCs增殖的反應(yīng)，結(jié)果證明即使在濃度為100μM時，HP-HSA對正常和PHA刺激的PBMCs的生長增殖均無明顯的影響。隨后，評估了HP-HSA對正常和PHA刺激的PBMCs分泌細(xì)胞因子IFN-γ功能的影響，結(jié)果同樣證明HP-HSA對正常和PHA刺激PBMCs的免疫功能無影響。這些結(jié)果初步證明

26、，HP-HSA對CD4+T細(xì)胞的功能，尤其是處于體內(nèi)循環(huán)狀態(tài)的T細(xì)胞不會產(chǎn)生有害的影響。但是，也不能排除長期應(yīng)用阻斷CD4受體的殺微生物劑可能會抑制陰道粘膜中的CD4+T細(xì)胞的免疫功能，這也正是我們下一步準(zhǔn)備進(jìn)行的安全性實(shí)驗(yàn)，評估HP-HSA對家兔陰道粘膜免疫系統(tǒng)的影響。
　　 性傳播是目前HIV傳播的主要途徑，因此人體精液和宮頸陰道液對抗HIV藥物活性影響的評估就顯得至關(guān)重要了。一般來說，理想的抗病毒藥物還應(yīng)該在存在大量體液時

27、，仍能保持較強(qiáng)的抗病毒活性。有文獻(xiàn)報道，精液的存在會降低一些候選殺微生物劑的活性[9]。本文結(jié)果可見，人體正常精液和陰道模擬液對HP-HSA的抗病毒活性并無顯著影響。
　　 （五）小結(jié)
　　 HP-HSA為水溶性蛋白，其無味，高濃度是呈淡黃色，制備簡單、快速、可重現(xiàn)，且其體外毒性、免疫功能和穩(wěn)定性評估證明其安全穩(wěn)定，具有被開發(fā)成抗病毒藥物的潛能。HP-HSA的優(yōu)勢:1）具廣譜抗病毒活性，能對抗HIV-1，HIV-2，SI

28、V和HSV的感染;2）能有效對抗各類藥物的耐受株，包括核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥株、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥株及T20耐藥株;3）HP-HSA為來源于人的大分子蛋白類藥物，其生物半衰期長;4）HSA來源于人類，其抗原性較低，不易誘導(dǎo)不利的免疫反應(yīng)。然而，HP-HSA作為蛋白類藥物可能存在價格較高、給藥方式較難選擇等缺陷。將兩類不同作用機(jī)制或不同作用靶點(diǎn)的新型抗病毒藥物與臨床應(yīng)用的抗病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用，將有效避免各自的優(yōu)缺點(diǎn)，取長補(bǔ)短，發(fā)揮各自