羅仙子有效部位抗小鼠動脈粥樣硬化的體內功效及對淋巴細胞的體外作用.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)嚴重危害人類的健康,免疫調控失衡在AS的發(fā)病機制中占有重要地位。羅仙子原名蛆,又稱五谷蟲,為我國傳統(tǒng)藥材之一,收錄于《本草綱目》蟲部第四十卷,具有清熱解毒、消滯化積及提高機體免疫力等功效。近年來,羅仙子在食品、保健品及藥品等方面的開發(fā)和利用引起社會的廣泛關注。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),羅仙子富含蛋白的提取物能夠有效改善AS小鼠動脈血管的粥樣化病變,顯著降低動物血清中相關炎癥因子水平;經

2、葡聚糖凝膠色譜分離、體外抗炎活性篩選、冷凍干燥等獲得分子量在30KD以下的活性部位,其在AS小鼠體內具有更好的抗AS功效,且發(fā)現(xiàn)其對免疫系統(tǒng)具有一定的調節(jié)作用。如前所述,免疫反應是影響AS進程的關鍵因素,而淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的主要細胞群體,淋巴細胞及其亞群在免疫反應中相互協(xié)作、互相制約,從而維持機體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。基于此,本文通過研究羅仙子有效部位在AS小鼠的體內功效以及對淋巴細胞的體外作用,從免疫調控的角度,初步探討羅仙子有效部位抗A

3、S的作用與機制。
　　研究目的:
　　通過觀察羅仙子有效部位(Oriental Latrine Fly Larvina-Effective Fraction,OLFL-EF)抗小鼠AS的體內功效,檢測其對動物血脂、炎癥因子及相關免疫分子表達的影響,結合胸主動脈及脾臟組織形態(tài)學以及淋巴細胞亞群CD4+/CD8+T細胞比例的變化情況,明確OLFL-EF在AS小鼠體內的治療作用以及對淋巴細胞分化的影響;以脾淋巴細胞及分離的T、B細

4、胞為實驗對象,通過體外實驗觀察OLFL-EF對上述細胞增殖、分化及分泌功能的影響,初步明確在抗AS過程中,OLFL-EF調節(jié)淋巴細胞功能的作用及機制。結合動物整體水平、細胞水平及分子水平實驗結果,從免疫調控的角度,初步闡明OLFL-EF抗AS的作用與機制。
　　研究方法:
　　1、OLFL-EF抗小鼠AS的體內功效
　　(1)AS小鼠模型構建:采用高膽固醇溶液灌胃聯(lián)合LPS肌肉注射的方法建立AS小鼠模型,以灌胃方式給予

5、OLFL-EF(200mg/kg/d)進行實驗干預。實驗設置正常對照組、陰性對照組、辛伐他汀組(25mg/kg/d)和OLFL-EF組,給藥6周后,觀察治療效果。
　　(2)OLFL-EF對AS小鼠血脂的調節(jié)作用:取血清,采用膽固醇氧化酶法檢測總膽固醇(TC)水平,磷酸甘油氧化酶法測定甘油三酯(TG)水平,聚乙烯硫酸選擇性沉淀法檢測低密度脂蛋白(LDL)水平以及磷鎢酸-鎂沉淀法檢測高密度脂蛋白(HDL)水平。
　　(3)OL

6、FL-EF對AS小鼠血清中炎癥因子及相關免疫分子的影響:采用ELISA法檢測炎癥因子TNFα及IL-6水平,以及免疫分子IL-10及TGF-β1水平。
　　(4)OLFL-EF對AS小鼠胸主動脈及脾臟組織形態(tài)學的影響:
　　①取小鼠胸主動脈,HE染色觀察胸主動脈的AS病理變化情況,并統(tǒng)計胸主動脈的內膜面積、中膜面積以及兩者的比例。
　?、谌⌒∈笃⑴K,HE染色觀察脾臟的組織形態(tài)學改變。
　?、鄄捎妹庖邿晒夥椒z測脾

7、臟中CD4+和CD8+T細胞的比例。
　　2、OLFL-EF對淋巴細胞的體外作用
　　(1)OLFL-EF對脾淋巴細胞的影響:
　?、僭囵B(yǎng)小鼠脾淋巴細胞,并在不同濃度的OLFL-EF的作用下,觀察由刀豆蛋白A(ConA)及脂多糖(LPS)分別誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖的影響,明確OLFL-EF的安全實驗濃度。
　?、贠LFL-EF對ConA誘導的脾淋巴細胞的影響:設正常對照組、ConA組和ConA/OLFL-E

8、F組,采用MTT法觀察在不同時間點OLFL-EF對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖的影響,流式細胞術檢測細胞周期分布,并采用流式細胞術檢測T細胞亞群CD4+和CD8+T細胞以及調節(jié)性T(Treg)細胞比例的變化。
　?、跲LFL-EF對LPS誘導的脾淋巴細胞的影響:設正常對照組、LPS組和LPS/OLFL-EF組,采用MTT法觀察在不同時間點OLFL-EF對LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖的影響,流式細胞術檢測細胞周期分布。

9、　　(2)OLFL-EF對T細胞的影響:采用尼龍毛柱法分離T、B細胞,設正常對照組、ConA組和ConA/OLFL-EF組,采用MTT法檢測OLFL-EF在不同時間點對T細胞增殖的影響;ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中炎性因子TNFα及IL-6水平,以及免疫分子IL-10和TGF-β1水平。
　　(3)OLFL-EF對B細胞的影響:采用尼龍毛柱法分離T、B細胞,設正常對照組、LPS組和LPS/OLFL-EF組,MTT法觀察OLFL-E

10、F在不同時間點對B細胞增殖的影響。
　　研究結果:
　　1、OLFL-EF抗小鼠AS的體內功效
　　(1)AS小鼠模型建立:高膽固醇溶液灌胃聯(lián)合LPS肌肉注射的方法可成功建立AS小鼠模型,模型組小鼠的胸主動脈出現(xiàn)典型的AS病變:內膜增厚,內皮細胞厚薄不均,內皮細胞壞死脫落,中膜的平滑肌細胞排列紊亂,內膜及中膜間隙明顯增大,可見泡沫細胞浸潤。胸主動脈的內膜面積、中膜面積顯著增大(P<0.01),兩者的比例也顯著升高(P<

11、0.01)。血清中TC、TG及LDL水平顯著升高(P<0.01),HDL水平顯著降低(P<0.01),炎癥因子TNFα及IL-6水平顯著升高(P<0.01),免疫分子IL-10及TGF-β1水平顯著降低(P<0.01)。
　　(2)OLFL-EF對AS小鼠血脂的調節(jié)作用:OLFL-EF處理6周后,血清中TC(陰性對照組vs.OLFL-EF組:6.39±0.14vs.4.53±0.05)、TG(陰性對照組vs.OLFL-EF組:3.

12、42±0.04vs.2.24±0.12)、LDL(陰性對照組vs.OLFL-EF組:3.37±0.07vs.1.91±0.08)水平顯著降低(P<0.01),HDL(陰性對照組vs.OLFL-EF組:0.83±0.15vs.1.05±0.07)水平升高(P<0.01)。
　　(3)OLFL-EF對AS小鼠血清中炎癥因子及相關免疫分子的影響:OLFL-EF處理6周后,血清中炎癥因子TNFα(陰性對照組vs.OLFL-EF組:1.74

13、±0.03vs.1.24±0.14)及IL-6(陰性對照組vs.OLFL-EF組:74.36±0.53vs.41.62±0.03)的水平顯著降低(P<0.01),免疫分子IL-10(陰性對照組vs.OLFL-EF組:25.23±0.31vs.59.89±0.21)和TGF-β1(陰性對照組vs.OLFL-EF組:82.27±0.11vs.187.14±0.18)的水平顯著升高(P<0.01)。
　　(4)OLFL-EF對AS小鼠胸

14、主動脈及脾臟的組織形態(tài)學的影響:
　?、傩∈笮刂鲃用}病理變化:OLFL-EF處理小鼠6周后,小鼠胸主動脈血管厚度明顯變薄,中膜與內膜輪廓邊緣清晰可見,泡沫細胞堆積減少,AS病變得到明顯改善。胸主動脈的內膜面積(陰性對照組vs.OLFL-EF組:8551.9±188.45vs.1874.2±132.32)、中膜面積(陰性對照組vs.OLFL-EF組:17215±243.52vs.14385±241.19)顯著增大(P<0.01),兩

15、者的比例(陰性對照組vs.OLFL-EF組:0.497±0.134vs.0.130±0.027)也顯著升高(P<0.01)。
　?、谄⑴K組織形態(tài)學變化:OLFL-EF處理小鼠后,小鼠的脾小體邊緣較清晰,可見生發(fā)中心有B細胞產生,動脈周圍淋巴鞘邊緣較小,T細胞數(shù)量減少。
　?、燮⑴K中CD4+和CD8+T細胞的比例變化:OLFL-EF處理小鼠后,T細胞的聚集減少,CD4+和CD8+T細胞比例降低。
　　2、OLFL-EF在

16、體外對淋巴細胞增殖、分化及分泌功能的影響
　　(1)OLFL-EF對脾淋巴細胞的影響
　?、僭囵B(yǎng)小鼠脾淋巴細胞的結果:小鼠脾淋巴細胞為懸浮生長,圓形,折光度好,均勻分散于培養(yǎng)介質中。
　?、诖_定安全有效實驗濃度:不同濃度的OLFL-EF作用于ConA及LPS分別誘導的小鼠脾淋巴細胞的實驗結果顯示,OLFL-EF在濃度為5-100μg/mL的范圍內,均能顯著促進脾淋巴細胞增殖(P<0.01),在濃度范圍5-40μg/

17、mL呈一定劑量的依賴性,在濃度為40μg/mL時,其促進細胞增殖的作用最為明顯,高于40μg/mL時,促增殖作用下降(可能是細胞毒性),故本實驗選取40μg/mL為最佳安全有效實驗濃度。
　　③OLFL-EF對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞的作用:
　　OLFL-EF在12h-72h的時間范圍內,均能顯著促進ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖(P<0.01),且在12h-48h的范圍內,呈一定的時間依賴性。在培養(yǎng)48h(ConA

18、組vs.ConA/OLFL-EF組:0.407±0.003vs.0.698±0.004)后,其增殖促進率(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:91.67±0.29vs.180.11±0.47)升高最為顯著。
　　流式細胞術檢測細胞周期分布的結果顯示:OLFL-EF能顯著降低ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞中G0/G1期細胞的百分比(P<0.01),升高S期和G2/M期細胞的百分比(P<0.01),在OLFL-EF處理48h后,

19、其S期分數(shù)(S-Phase fraction,SPF)(12.23±0.2％)及增殖指數(shù)(Proliferation index,PI)(21.50±0.96%)最大,表明在48h時,OLFL-EF促進ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期的作用最明顯。
　　流式細胞術檢測T細胞亞群CD4+和CD8+T細胞比例的結果顯示:OLFL-EF處理細胞24h、48h和72h后,CD4+T細胞比例顯著降低(P<0.0

20、1),CD4+/CD8+比值在24h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:1.60±0.35vs.1.34±0.89)、48h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:1.64±0.21VS1.26±0.28)、72h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:1.63±0.43vs.1.24±0.31)均顯著降低(P<0.01),分別下降了0.26、0.38和0.39。
　　流式細胞術檢測Treg細胞比例的結果顯示

21、:OLFL-EF處理細胞24h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:6.21±0.13vs.7.49±0.22)、48h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:6.96±0.32vs.10.22±0.78)后,Treg細胞比例顯著升高(P<0.01)。
　?、躉LFL-EF對LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞的作用:
　　OLFL-EF在不同時間點對LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞的作用結果顯示:OLFL-EF在12h-72

22、h的范圍內,均能顯著促進LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖(P<0.01),在12h-48h的范圍內,呈一定的時間依賴性。培養(yǎng)48h(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:0.356±0.003vs.0.565±0.002)后,其增殖促進率(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:71.37±0.93vs.102.15±0.32)最大,OLFL-EF促進LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖效果最明顯。
　　流式細胞術檢測細胞周期分布的結果

23、顯示:OLFL-EF能顯著降低LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞中G0/G1期細胞的百分比(P<0.01),升高S期和G2/M期細胞的百分比(P<0.01),在OLFL-EF處理72h后,其SPF值(6.03±0.59%)及PI值(13.24±0.45%)最大,表明在72h時,OLFL-EF促進細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期的作用最明顯。
　　(2)OLFL-EF對T細胞的影響
　　尼龍毛柱法將T、B細胞分離后,T細胞經OL

24、FL-EF處理24h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:0.305±0.003vs.0.265±0.015)和48h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:0.315±0.032vs.0.242±0.008)后,能顯著抑制T細胞增殖(P<0.01),其增殖率在48h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:5.15±0.13vs.-7.41±0.06)時最小,表明在48h時,OLFL-EF能顯著抑制T細胞增殖(P<0

25、.01)。
　　培養(yǎng)液上清中炎癥因子TNFα(正常對照組vs.OLFL-EF組:1.22±0.13vs.1.14±0.145)及IL-6(正常對照組vs.OLFL-EF組:40.58±0.26vs.33.42±0.13)水平顯著降低(P<0.01),免疫分子IL-10(正常對照組vs.OLFL-EF組:63.17±0.45vs.72.47±0.18)和TGF-β1(正常對照組vs.OLFL-EF組:190.31±0.23vs.19

26、9.14±0.48)水平顯著升高(P<0.01)。
　　(3)OLFL-EF對B細胞的影響
　　OLFL-EF處理B細胞24h(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:0.323±0.004vs.0.345±0.021)和48h(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:0.346±0.017vs.363±0.013)后,能顯著促進B細胞增殖(P<0.01),其增殖率在48h(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:27.48