基于細胞水平的抗骨質(zhì)疏松中藥藥效學評價方法的建立.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是危害人類健康的主要疾病之一，尋找切實有效的抗骨質(zhì)疏松藥物已成為當今醫(yī)學領域的重大課題。傳統(tǒng)中藥里有許多活性物質(zhì)具有抗骨質(zhì)疏松作用，又因其具有副作用小等優(yōu)點，在治療骨質(zhì)疏松中發(fā)揮著越來越重要的作用。但長期以來，臨床醫(yī)生只是憑經(jīng)驗使用中藥來治療疾病，中藥成分復雜，即便是臨床上經(jīng)常使用的中藥，也很少有人去研究它們的作用機制。目前中藥現(xiàn)代化的實現(xiàn)和細胞培養(yǎng)技術的逐步發(fā)展，使得在更深的層次上研究中藥的藥理作用成為可能。本研究的目的就是

2、建立一種基于細胞水平的抗骨質(zhì)疏松中藥藥效學的評價方法。 首先，建立成骨細胞和破骨細胞的體外培養(yǎng)方法。通過酶消化法獲得新生大鼠的成骨細胞。通過堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定成骨細胞；用1,25(OH)2D3誘導骨髓單核細胞獲得破骨細胞，并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色進行鑒定。最后應用激光共聚焦顯微技術，BodipyFLPhallacidin熒光抗體和碘化丙啶(PI)進行標記后，觀察兩種細胞的細胞骨架F-actin。

3、然后本文采用傳統(tǒng)血清藥理學的方法制備含藥血清，并對這一方法進行了改進。傳統(tǒng)的方法是對成年大鼠直接灌胃給藥，一段時間后取血制備含藥血清。我們知道，骨質(zhì)疏松癥有很大一部分發(fā)生在絕經(jīng)后的女性，雌激素的下降對骨質(zhì)疏松癥有著明顯的作用。而本文在灌胃前將雌性SD大鼠進行去勢處理，消除血清中雌激素的影響，從而更好的研究血清中的藥物成分對細胞功能的影響。 再次，我們用體外培養(yǎng)的成骨細胞，建立了抗骨質(zhì)疏松中藥作用于骨形成的藥效學評價方法。通過WS

4、T-1檢測細胞代謝情況與增殖活力，用酶標儀檢測成骨細胞分泌堿性磷酸酶和胰島素樣生長因子的功能。最后加入龜鹿復方不同劑量組10％含藥血清，觀察其對成骨細胞各項功能指標的影響。結果發(fā)現(xiàn)，高劑量組血清可明顯促進成骨細胞增殖、ALP活性和IGF-1的分泌，說明龜鹿復方可以促進成骨細胞的骨形成。 最后，我們用體外培養(yǎng)的破骨細胞，建立抗骨質(zhì)疏松中藥作用于骨吸收的藥效學評價方法。我們用掃描電鏡(ScanningMicroscope)技術觀察破

5、骨細胞形成的骨凹陷；同時檢測TRAP(+)細胞數(shù)和破骨細胞TRAP活性。最后加入龜鹿復方含藥血清進行干預，方法同成骨細胞。結果表明，中劑量組血清可明顯抑制骨髓細胞向破骨細胞轉(zhuǎn)化，抑制骨凹陷形成，降低細胞內(nèi)TRAP的活性，減少TRAP(+)細胞數(shù)。說明龜鹿復方可以抑制破骨細胞的骨吸收功能。 綜上所述，本文建立了基于細胞水平的抗骨質(zhì)疏松中藥的藥效學評價方法，并加入中藥龜鹿復方進行驗證。發(fā)現(xiàn)龜鹿復方的抗骨質(zhì)疏松作用機制可能跟以下2個方