熱休克蛋白72抑制腎臟纖維化分子機(jī)制的研究.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭(ESRD)的主要病理基礎(chǔ)和共同途徑，RIF的程度是預(yù)測(cè)腎臟病慢性進(jìn)展速度的獨(dú)立因素。研究證明，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化增殖是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增加和大量積聚的主要原因，在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮極其重要的作用。因此，研究腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化增殖的調(diào)控機(jī)制，探索腎臟纖維化的防治措施，有助于延緩慢性腎臟病的進(jìn)展，為開發(fā)治療腎臟纖維化的新途徑奠定科學(xué)依據(jù)。HSP72(HS

2、P72)是一種細(xì)胞保護(hù)性蛋白，由2個(gè)主要的功能結(jié)構(gòu)域參與分子伴侶的作用：C端的多肽結(jié)合區(qū)(PBD)，負(fù)責(zé)底物的結(jié)合和折疊；核定位序列(NLS)，決定HSP72在應(yīng)激狀態(tài)下的核聚集。我們前期的研究證明，HSP72可抑制EMT，延緩腎臟纖維化進(jìn)程。其他學(xué)者則發(fā)現(xiàn)，加熱誘導(dǎo)大鼠高表達(dá)HSP72能抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對(duì)心房成纖維細(xì)胞的激活和延緩心房纖維化。然而，關(guān)于HSP72調(diào)控EMT的分子機(jī)制，以及能否直接抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化和

3、功能，目前尚不清楚。因此，本研究針對(duì)以上問題進(jìn)行了如下探討。
　　 ㈠HSP72調(diào)控EMT的分子機(jī)制。
　　 (1)體外研究。
　　 目的：探討HSP72對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路的調(diào)控作用，揭示HSP72抑制EMT的分子機(jī)制。
　　 方法：10ng/ml TGF-β1刺激腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)48小時(shí)，建立EMT模型。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和RNA干擾，分別上調(diào)野生型HSP72(Wt-HSP72

4、)或變異型HSP72(HSP72-△PBD和HSP72-△NLS)表達(dá)和下調(diào)HSP72表達(dá)。以Western印跡檢測(cè)E-cadherin，α-SMA的表達(dá)和Smad2、磷酸化Smad2(p-Smad2)、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)和Smad7的蛋白含量；間接免疫熒光觀察HSP72和Smad3/p-Smad3的細(xì)胞定位；聯(lián)合免疫沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)分析HSP72與Smad3之

5、間的相互作用。
　　 結(jié)果：TGF-β1能誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)下調(diào)和α-SMA表達(dá)上調(diào)；特異性高表達(dá)HSP72或HSP72-△NLS均可明顯減輕TGF-β1介導(dǎo)的EMT現(xiàn)象，特異性下調(diào)HSP72表達(dá)則加重TGF-β1誘導(dǎo)EMT，而HSP72-△PBD不能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。Western-blot結(jié)果顯示，TGF-β1刺激使p-Smad2和p-Smad3呈時(shí)間依賴性升高；HSP72或HSP7

6、2-△NLS過表達(dá)能明顯降低各時(shí)間點(diǎn)p-Smad3的水平，以及細(xì)胞核內(nèi)p-Smad3的聚集，而HSP72-△PBD過表達(dá)不能阻抑Smad3的活化和核易位。免疫熒光和激光共聚焦結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，HSP72能減少Smad3/p-Smad3在細(xì)胞核的聚集。過表達(dá)野生型和變異型HSP72均使Smad7蛋白含量增加，但不影響Smad2的磷酸化。Co-IP結(jié)果顯示，HSP72與Smad3/p-Smad3均存在相互作用，而且隨著HSP72的表達(dá)增高，H

7、SP72與Smad3的結(jié)合增加；HSP72-△NLS僅在細(xì)胞漿與Smad3結(jié)合；HSP72-△PBD則完全不能與Smad3相互作用。
　　 (2)體內(nèi)研究。
　　 目的：探討大鼠UUO模型中HSP72對(duì)EMT相關(guān)的Smads蛋白的影響。
　　 方法：雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組，開腹不結(jié)扎輸尿管)、單側(cè)輸尿管梗阻模型組(UUO模型組，開腹后結(jié)扎右側(cè)輸尿管)和GGA

8、干預(yù)組。每組各6只大鼠。建立模型前1天開始，GGA干預(yù)組和模型組分別給予400mg/kg GGA和溶媒(0.05％阿拉伯樹膠+0.008％維生素E)灌胃，每天1次。術(shù)后第7天處死大鼠，并留取右側(cè)腎組織。Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)HSP72和Smads蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：Western-blot顯示，UU0模型組腎臟組織p-Smad2和p-Smad3水平明顯升高，Smad7蛋白水平顯著下降；GGA可特異性誘導(dǎo)

9、大鼠腎臟HSP72高表達(dá)，抑制p-Smad3，刺激Smad7上調(diào)表達(dá)，但不影響p-Smad2的水平。免疫熒光顯示p-Smad3主要分布在腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，GGA可顯著減少p-Smad3的表達(dá)。
　　 小結(jié)：①HSP72可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。②HSP72通過與Smad3/p-Smad3結(jié)合，降低TGF-β1介導(dǎo)的p-Smad3水平，減少p-Smad3的細(xì)胞核易位，從而阻止EMT的發(fā)生和發(fā)展。HSP72的PBD

10、功能域是HSP72發(fā)揮上述保護(hù)作用的必要分子結(jié)構(gòu)。但是HSP72不影響Smad2的磷酸化。③HSP72穩(wěn)定TGF-β1作用下Smad7的蛋白水平。④GGA可特異性誘導(dǎo)腎臟組織HSP72高表達(dá)，顯著抑制UUO模型Smad3磷酸化，并明顯增加Smad7蛋白含量，但對(duì)Smad2活化沒有抑制作用。
　　 ㈡HSP72對(duì)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化增殖的影響及其分子機(jī)制。
　　 (1)體外研究。
　　 目的：探討HSP72對(duì)腎臟成

11、纖維細(xì)胞活化增殖和功能異常的影響及機(jī)制。
　　 方法：2ng/ml TGF-β1刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞株(NRK-49F)24小時(shí)，誘導(dǎo)其活化和增殖。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNA干擾方法分別上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞HSP72的蛋白水平。以Western印跡檢測(cè)α-SMA，F(xiàn)ibronectin，CollagenⅠ和CollagenⅢ的含量。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察細(xì)胞增殖情況，BrdU吸收率檢測(cè)細(xì)胞DNA合成情況，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，

12、流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡的發(fā)生率，侵襲力實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移力。Western blot檢測(cè)PCNA，Bcl-xl，Bcl-2，Survivin，Bax蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布和變化。Western blot和免疫熒光染色分別檢測(cè)Stat3活化情況和細(xì)胞內(nèi)分布。Co-IP檢測(cè)HSP72與Stat3相互作用。轉(zhuǎn)染含Stat3反應(yīng)元件的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)Stat3轉(zhuǎn)錄活性。
　　 結(jié)果：TGF-β1呈劑量及時(shí)間依賴性誘導(dǎo)

13、NRK-49F細(xì)胞表型改變和形態(tài)學(xué)變化，阻止細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降低細(xì)胞的遷移力。HSP72通過抑制細(xì)胞活力和DNA合成，減少PCNA，Survivin和Bcl-xl蛋白的表達(dá)，阻抑TGF-β1介導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，HSP72不能抑制NRK-49F細(xì)胞的凋亡，但是HSP72使TGF-β1作用下NRK-49F細(xì)胞周期分布發(fā)生顯著變化，細(xì)胞主要停滯于G1期，并分別下調(diào)和上調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin

14、D1和p21的含量。Westem blot和免疫熒光結(jié)果顯示，HSP72高表達(dá)可顯著抑制TGF-β1作用下的Stat3活化和核易位。熒光素酶報(bào)告基因證明，HSP72能降低Stat3轉(zhuǎn)錄活性。Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSP72與Stat3之間存在相互作用，且HSP72高表達(dá)時(shí)該作用明顯增強(qiáng)。
　　 (2)體內(nèi)研究。
　　 目的：探討HSP72對(duì)腎臟組織Stat3蛋白表達(dá)以及活化的影響。
　　 方法：應(yīng)用GGA特異性誘導(dǎo)

15、HSP72在腎臟高表達(dá)，或GGA給藥前2小時(shí)腹腔注射槲皮素Quercetin(100mg/kg)。建立大鼠UUO模型，7天后處死大鼠留取腎組織標(biāo)本，Western blot和間接免疫熒光檢測(cè)α-SMA，F(xiàn)ibronectin，CollagenⅠ蛋白表達(dá)和Stat3活化情況；Picrosirius Red染色檢測(cè)組織中膠原蛋白含量。
　　 結(jié)果：大鼠UUO7天時(shí)，腎臟組織α-SMA，F(xiàn)ibronectin，CollagenⅠ和Co

16、llagenⅢ蛋白表達(dá)明顯增多，磷酸化Stat3(p-Stat3)水平顯著增加。免疫熒光結(jié)果顯示，p-Stat3主要分布在腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)。GGA誘導(dǎo)腎臟HSP72高表達(dá)，可顯著抑制α-SMA，F(xiàn)ibronectin的表達(dá)和膠原蛋白的含量，以及p-Stat3水平和細(xì)胞核易位；槲皮素抑制GGA誘導(dǎo)的HSP72蛋白表達(dá)水平，并消除GGA阻抑Stat3活化和腎臟纖維化的保護(hù)作用。
　　 小結(jié)：①HSP72可顯著抑制TGF-β1作用下成

17、纖維細(xì)胞的活化增殖和功能。②HSP72降低TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的Cyclin D1表達(dá)水平，升高p21的表達(dá)，抑制DNA合成，使細(xì)胞停滯于G1期，從而阻抑細(xì)胞增殖。③HSP72通過抑制TGF-β1作用下成纖維細(xì)胞Stat3的活化水平、p-Stat3細(xì)胞核易位以及降低Stat3的轉(zhuǎn)錄活性，阻止Stat3介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和存活。④GGA誘導(dǎo)HSP72高表達(dá)可顯著降低大鼠UUO模型腎組織p-Stat3水平和細(xì)胞核易位，抑制腎間質(zhì)纖維化的程

18、度。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴HSP72通過抑制腎小管上皮細(xì)胞Smad3的磷酸化，p-Smad3細(xì)胞核易位，以及上調(diào)Smad7，調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路介導(dǎo)的EMT。
　　 ⑵HSP72的PBD結(jié)構(gòu)域是HSP72發(fā)揮抗EMT作用的關(guān)鍵功能域。
　　 ⑶HSP72通過抑制成纖維細(xì)胞Stat3的活化水平、p-Stat3細(xì)胞核易位以及降低Stat3的轉(zhuǎn)錄活性，阻止Stat3介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞侵襲