膽道閉鎖肝病理學(xué)診斷價值及熱休克蛋白47與肝纖維化相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　1.結(jié)合國外膽道閉鎖(BA)肝臟病理半定量標(biāo)準(zhǔn)，初步建立我國相應(yīng)的BA肝臟病理半定量評分標(biāo)準(zhǔn)以及預(yù)后指標(biāo)，探討肝臟病理學(xué)半定量評分系統(tǒng)在BA術(shù)前早期診斷中的價值，分析肝臟病理評估參數(shù)與BA預(yù)后的相關(guān)性，為BA預(yù)后的判斷提供可靠依據(jù);
　　2.研究熱休克蛋白47(HSP47)在BA患兒肝臟組織及血清中的表達(dá)變化，分析HSP47與BA肝組織纖維化程度的相關(guān)性，探討HSP47作為BA預(yù)后隨訪指標(biāo)的可行性。
　　方

2、法:
　　一、膽道閉鎖(BA)肝臟病理學(xué)評分的診斷價值及與預(yù)后相關(guān)性探討:
　　1.病例入組標(biāo)準(zhǔn)及預(yù)后評估標(biāo)準(zhǔn):收集復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院外科2012年6月至2013年7月間收治入院手術(shù)的96例梗阻性黃疸患兒入組，根據(jù)術(shù)中膽道造影診斷結(jié)果將患兒分為BA組共58例（Ⅲ型）與非BA組共28例（除外PFIC、膽道發(fā)育不良、Allagie綜合征）。分別記錄各組病例性別、年齡、術(shù)前與術(shù)后肝功能及術(shù)后隨訪等臨床資料。同時選取入組病例術(shù)后肝

3、臟組織蘇木精—伊紅(hematoxyl in-eosinstaining，HE)染色病理切片各1張并隨機編號，由一名對診斷結(jié)果未知的專業(yè)病理醫(yī)師解讀病理切片，運用基于8個病理特征（肝臟纖維化、膽小管增生、匯管區(qū)膽栓形成、膽汁淤積、肝細(xì)胞病變、匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤、髓外造血、膽管板發(fā)育異常），總分為21分的半定量肝臟組織病理評分系統(tǒng)對各組病例肝臟的相關(guān)病理特征進(jìn)行半定量評分，記錄得分，做出病理診斷。同時根據(jù)BA患兒術(shù)后半年血膽紅素水平，將入

4、組BA忠兒再分為預(yù)后良好組（膽紅素降至正常水平）與預(yù)后不良組（膽紅素高于正常水平）。
　　2.比較各組病例肝臟組織病理診斷與術(shù)中膽道造影診斷符合率，并分析BA患兒肝臟組織相關(guān)病理特征與其預(yù)后相關(guān)性。
　　二、熱休克蛋白47(HSP47)在BA患兒肝臟組織及血清中的表達(dá)變化及其與BA患兒肝纖維化程度相關(guān)性研究:
　　分別選取20例BA、10例膽汁淤積、10例膽總管囊腫術(shù)中活檢的肝臟組織及術(shù)后肝臟組織病理切片，應(yīng)用熒光定量

5、RT-PCR和western blot檢測各組肝臟組織中HSP47mRNA及蛋白水平表達(dá)量變化;同時根據(jù)Okhuma‘s分級標(biāo)準(zhǔn)，光學(xué)顯微鏡下觀察各組病例肝臟組織HE染色病理切片，比較各組肝組織纖維化程度;此外，運用ELISA實驗檢測比較各組患兒血清中HSP47蛋白表達(dá)水平變化。分析HSP47與BA肝臟纖維化程度相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　一、膽道閉鎖(BA)肝臟病理學(xué)評分的診斷價值及與預(yù)后相關(guān)性探討:
　　1.入組96

6、例梗阻性黃疸患兒，根據(jù)術(shù)中膽道造影診斷，共有58例BA（男性33例，女性26例）及28例膽汁淤積癥（男性22例，女性6例），兩組患兒平均年齡及性別比無明顯差異。BA組患兒總膽紅素、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及膽汁酸水平分別為173.9±66.4，605.0±223.4，171.4±114.3，111.9±85.5，與膽汁淤積癥組患兒相比，均無顯著差異(157.8±64.5，603.6±301.3，140.5±105.7，129.

7、8±116.2)，而BA組患兒谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶及直接膽紅素水平較膽汁淤積組顯著較高(859.2±688.5 vs.404.1±400.2，P＜0.01;134.2±50.1vs.110.5±41.8,P＜0.05)。
　　2.依據(jù)肝臟組織病理學(xué)評分（8個特征-21分制），BA組肝臟組織病理學(xué)平均評分分值明顯高于膽汁淤積組(10.9±2.2 vs.5.9±1.3，P＜0.001)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)依據(jù)肝臟組織病理學(xué)評分系統(tǒng)，當(dāng)評分分值

8、≥8分時，診斷BA的機率隨著分值的升高而逐漸增加，其診斷敏感度和特異度分別為93.1％和99.8％，當(dāng)評分分值＜8分時，診斷膽汁淤積而非BA得機率則隨著分值的升高而逐漸增加，診斷的敏感性和特異度分別為85.7％和99.9％?？傮w上使用肝臟組織病理學(xué)評分系統(tǒng)診斷BA的敏感性、特異性及準(zhǔn)確率分別為94.7％、86.2％和91.9％，明顯高于傳統(tǒng)BA病理診斷方法(敏感性、特異性及準(zhǔn)確率:86.4％、74.1％及82.6％;P＜0.01)。

9、r>　　3.BA組肝臟組織病理學(xué)評分分值大小與BA患兒性別、總膽紅素水平、總膽汁酸無明顯相關(guān)性(r1=-0.14，P1＞0.05;r2=0.181，P2＞0.05;r3=0.103，P3＞0.05)，而與BA患兒的年齡分布、直接膽紅素水平及谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平呈正相關(guān)，(r1=0.289，P1＜0.01, r2=0.272，P2＜0.01, r3=0.367，P3＜0.01)。
　　4.所有BA組患兒均存在不同程度的肝臟組織纖維化，以

10、中度肝臟纖維化以上為主，肝纖維化率及程度較膽汁淤積組明顯，后者僅有14.2％患兒存在輕度肝臟組織纖維化;BA組膽管增生率為92.1％，較膽汁淤積組(25％)明顯升高;膽栓形成及膽管板發(fā)育異常僅見于膽道閉鎖組，發(fā)生率分別為51.7％％和17.2％，(vs.膽汁淤積組，P＜0.01)。肝臟纖維化與患兒年齡呈正相關(guān)，纖維化程度越嚴(yán)重，提示遠(yuǎn)期預(yù)后不佳。
　　二、熱休克蛋白47(HSP47)在BA患兒肝臟組織及血清中的表達(dá)變化及其與BA患

11、兒肝纖維化程度相關(guān)性研究:
　　1.BA組肝臟組織中HSP47 mRNA水平相對表達(dá)量為0.915±0.730較膽汁淤積組及膽總管囊腫組顯著增高（0.066±0.037與0.314±0.150，P＜0.05）;同時HSP47蛋白在BA組肝臟組織中的表達(dá)水平明顯高于膽汁淤積組及膽總管囊腫組。
　　(3.06181±0.504763 vs1.358018±0.373174,3.06181±0.504763 vs1.23649±0

12、.350173)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.BA組患兒血清中HSP47蛋白平均濃度為63.38±17.11，均高于膽汁淤積組(57.87±14.83)及膽總管囊腫組(45.78±11.23)。
　　4.BA組肝臟組織中HSP47 mRNA，蛋白水平表達(dá)量與HSP47血清濃度間呈正相關(guān)(mRNA水平VS蛋白水平r=0.836，P＜0.05，蛋白水平VS血清濃度r=0.989，P＜0.01，mRNA水平VS血

13、清濃度r=0.883，P＜0.05)。
　　5.結(jié)合光鏡下觀察肝臟組織HE染色切片按照Okhuma‘s肝纖維化分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝纖維化程度分級情況，血清HSP47的表達(dá)與肝纖維化程度成正相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.669，P＜0.01）。與術(shù)后半年內(nèi)膽紅素指標(biāo)是否降至正常內(nèi)關(guān)系不顯著，不具備統(tǒng)計學(xué)意義，根據(jù)隨訪至今存活情況行Logic回歸分析，血清HSP47的表達(dá)與術(shù)后生存情況存在相關(guān)性（x2=5.417，P=0.02＜0.05）。

14、
　　結(jié)論:
　　1.肝組織病理評分（8個特征-21分制）對于BA診斷及BA與其他膽汁淤積癥間的鑒別診斷較以往的病理診斷方法具有更高的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。
　　2.通過肝臟病理評分系統(tǒng)分析相關(guān)病理特征的程度與膽道閉鎖患兒預(yù)后情況，具備可行性。
　　3.熱休克蛋白47在肝臟組織及血清表達(dá)具有一致性，表達(dá)量與肝臟纖維化程度呈正相關(guān)，能夠提示膽道閉鎖患兒肝臟纖維化程度。
　　4.血清熱休克蛋白47的表達(dá)情況可