大口黑鱸肝細胞原代培養(yǎng)方法的建立及其應用于CYP450的誘導研究.pdf

1、本論文從水產(chǎn)動物肝臟細胞的原代培養(yǎng)入手，篩選出一最適的肝臟組織，在此基礎(chǔ)上建立一種穩(wěn)定的肝細胞原代培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)的原代肝細胞應用于藥物代謝酶的誘導研究，以期為藥物代謝酶的體外誘導研究奠定基礎(chǔ)。 采用組織塊法和消化法比較研究了草魚、鳊魚、鯽魚、鯉魚、鱸魚、鱘魚、(魚回)魚、甲魚等水產(chǎn)動物肝臟組織的原代培養(yǎng)，其中消化法比較研究不同胰蛋白酶濃度及消化時間對細胞分離效果的影響，以消化的難易程度、消化所得細胞的數(shù)量及活力等參數(shù)為評價指標

2、，最終篩選出鱸魚肝臟為最適宜的肝細胞原代培養(yǎng)組織。進一步優(yōu)化肝細胞的分離方法和培養(yǎng)條件，建立了在本實驗室條件下大規(guī)模、長期培養(yǎng)原代肝細胞的方法。通過對肝細胞的培養(yǎng)上清液中LDH、ALb含量等指標的檢測，確定了肝細胞功能表達的最佳時期，并將其應用于藥物代謝酶的誘導研究。 結(jié)果表明：(1)肝臟組織的篩選；通過采用組織塊法和消化法對草魚、鳊魚、鯽魚、鯉魚、鱸魚、鱘魚、(魚回)魚、甲魚等水產(chǎn)動物肝臟組織原代培養(yǎng)的比較研究，組織塊法均未見

3、細胞從組織塊中遷出，該法不適合肝細胞的原代培養(yǎng)；消化法分離肝細胞，其中鱸魚肝組織獲得最佳分離效果，0.25％胰蛋白酶消化20min，每克肝重可獲得0.9×106個細胞，細胞活力達到89％，通過短期培養(yǎng)，初步判定鱸魚的肝臟組織適于本實驗室條件下體外分離消化，并可大規(guī)模培養(yǎng)。(2)鱸魚肝細胞原代培養(yǎng)方法的建立；胰蛋白酶濃度0.25％，消化時間20min，分步收集肝細胞，經(jīng)臺盼藍檢測和血球計數(shù)板計數(shù)，平均活力＞90％，每克肝重可獲得3×106

4、個分離肝細胞。在細胞活力和數(shù)量兩方面達到最佳平衡。在含20％胎牛血清、10μg/mL胰島素的M199/L15培養(yǎng)基中，于4％CO2，28℃培養(yǎng)箱中長期培養(yǎng)并可傳代。(3)鱸魚原代肝細胞損傷和代謝能力的檢測；鱸魚肝細胞在培養(yǎng)觀察14d的過程中，在3-4d內(nèi)LDH滲出量增加，隨培養(yǎng)時間的延長，其分泌量呈下降趨勢。白蛋白的分泌量在培養(yǎng)的3-5d中呈上升趨勢，在4-8d維持一較高水平，此后，隨著培養(yǎng)時間的延長，白蛋白逐漸減少。綜合LDH滲出量、

5、ALb分泌量的變化，選擇培養(yǎng)至第5d的鱸魚原代肝細胞應用于藥物代謝酶的檢測。(4)CYP450的誘導研究；取培養(yǎng)至第5d的鱸魚原代肝細胞應用于CYP450酶系中的氨基比林-N-脫甲基酶的誘導研究，以利福平為誘導劑，氨基比林為底物，40μmol利福平誘導24h后，鱸魚原代肝細胞中氨基比林-N-脫甲基酶活性最高，初步判定其由CYP3A4，CYP2C9介導。 隨著人們對藥物使用安全性的認識由以前的“靶動物安全，”到“食品安全”的轉(zhuǎn)變，