錳對原代培養(yǎng)肉雞肝細胞脂肪合成關(guān)鍵酶活性及其基因表達的影響.pdf

1、本論文通過3個試驗,研究了不同錳水平和不同形態(tài)錳源對體外原代培養(yǎng)肉雞肝臟細胞脂肪合成關(guān)鍵酶[脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase,FAS)、蘋果酸脫氫酶(MalicDehydrogenase,MDH)]活性及其基因表達的影響,從細胞及分子水平探討了錳對肉雞脂肪合成影響的可能作用機制。
　　 試驗一旨在建立穩(wěn)定、可靠的肉雞肝細胞體外原代培養(yǎng)技術(shù)體系,為下一步研究錳對肉雞肝細胞脂肪合成關(guān)鍵酶的影響奠定方法學基礎(chǔ)。本試

2、驗以健康的21～24日齡的AA肉公雞為試驗動物,采用改良的原位兩步灌注法分離肝臟細胞,以Leibovitz's L-15培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)。結(jié)果表明:采用改良的原位兩步灌注法分離的肉雞肝臟細胞,分散程度高,純度好,經(jīng)血細胞計數(shù)板計數(shù),一只21～24日齡的肉仔公雞的肝臟可以獲得(2±1)×109個細胞,臺盼藍拒染法測得細胞活率均在95％以上；以Leibovitz's L-15培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液對肝細胞進行單層原代培養(yǎng),培養(yǎng)7天

3、肝細胞仍能維持正常的細胞形態(tài),可滿足后續(xù)試驗的需要。
　　 試驗二研究不同錳(源于無機氯化錳)水平對21～24日齡的肉公雞原代培養(yǎng)肝細胞中脂肪合成關(guān)鍵酶活性及其基因表達的影響。本試驗所用肉仔雞從1日齡至手術(shù)前均飼喂除錳外所用營養(yǎng)成分均滿足NRC(1994)建議的1～3周肉仔雞營養(yǎng)需要量的玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(含錳為19.69mg／kg),使試雞處于臨界缺錳狀態(tài)。本研究共包括兩個試驗。試驗1根據(jù)添加不同錳水平對肉仔雞肝細胞乳酸脫氫

4、酶(lactic dchydrogenase,LDH)漏山的影響,米確定培養(yǎng)液添加錳濃度的非毒性范圍及適宜錳添加水平。試驗2根據(jù)試驗1的結(jié)果,在培養(yǎng)液中添加不同水平的錳培養(yǎng)肝細胞一定的時間,研究不同錳水平對原代培養(yǎng)的肉仔雞肝細胞中脂肪酸合成酶活性和基因表達的影響。試驗1采用單因子完全隨機試驗設(shè)計,在培養(yǎng)液中分別添加0 mM、0.02 mM、0.2 mM、0.5 mM和1 mM錳,共5個處理組,分別培養(yǎng)24h和48h,每個處理6個重復,每

5、只雞分離得到的肝細胞為一個重復。結(jié)果表明:肉仔雞肝細胞經(jīng)不同錳水平培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24h和48h后,均顯著降低了肝細胞LDH的漏出(p＜0.0001),肝細胞培養(yǎng)液中L,DH的活性隨錳添加水平的增加呈明顯的二次曲線降低,錳的適宜添加水平為0.56～0.57 mM,錳添加水平為1mM時沒有對肝細胞產(chǎn)生毒性。試驗2采用單因子完全隨機試驗設(shè)計,在培養(yǎng)液中分別添加0mM、0.25 mM、0.5 mM和0.75 mM錳,共4個處理組,分別培養(yǎng)24h

6、和48h,每個處理6個重復,每只雞分離得到的肝細胞為一個重復。結(jié)果表明:不同錳添加水平培養(yǎng)液培養(yǎng)24h對肝細胞中FAS和MDH活性及其mRNA水平均無顯著影響(p＞0.24),但添加錳有降低MDHmRNA水平的趨勢。不同錳添加水平培養(yǎng)液培養(yǎng)48h,顯著降低了肝細胞中FAS和MDHmRNA水平(p＜0.001),且隨著錳添加水平的增加,FAS和MDH mRNA水平有下降趨勢；添加錳對FAS和MDH的活性無顯著影響(p＞0.17),但添加錳

7、有降低FAS和MDH活性的趨勢。
　　 試驗三研究不同水平及形態(tài)錳源對21～24日齡肉公雞原代培養(yǎng)肝細胞LDH的漏出、肝細胞中脂肪合成關(guān)鍵酶(FAS和MDH)活性及其基因表達的影響。試雞飼糧同試驗二。試驗采用2×2兩因子完全隨機設(shè)計,兩種錳源分別為中等絡(luò)合強度氨基酸錳(MnAA)和無機氯化錳,兩個錳添加水平分別為0.25 mM和0.5mM,兩種錳源共用一個不添加錳對照組,共組成5個處理組,各處理培養(yǎng)液培養(yǎng)肉仔雞肝細胞48h,每個

8、處理6個重復,每只雞分離得到的肝細胞為一個重復。結(jié)果表明:添加錳可顯著降低肝細胞[.DH的漏出、肝細胞中FAS和MDH mRNA的表達量(p＜0.0001)及FAS活性(p＜0.004):添加錳水平對肝細胞MDH mRNA的表達量(p＜0.02)有顯著影響,但添加錳源以及錳源與錳水平互作對肝細胞MDH mRNA的表達量無顯著影響:添加錳源、錳水平以及錳源與錳水平互作對肝細胞LDH的漏出及肝細胞中FAS mRNA的表達量均無顯著影響(p＞