益氣活血法和補(bǔ)腎生髓法對體外培養(yǎng)和腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響.pdf

1、目的依據(jù)中醫(yī)腦髓學(xué)說、氣血相關(guān)理論和缺血性腦卒中“氣虛血瘀”病機(jī)學(xué)說，借助益氣活血法代表方腦絡(luò)欣通和補(bǔ)腎生髓法代表方左歸丸，比較觀察兩種不同中醫(yī)治法對誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，以及神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)水平的影響，從神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和調(diào)控角度探討不同中醫(yī)治法在修復(fù)缺血性腦損傷中的作用及其機(jī)制。 方法1分離E14胎鼠大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下組織，通過原代細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、單細(xì)胞克隆和免疫細(xì)胞熒光化學(xué)方法，用神經(jīng)干細(xì)胞的特異性巢蛋白單克隆抗體(

2、神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白Nestin)、增殖細(xì)胞單克隆抗體(5-溴脫氧尿苷嘧啶BrdU)、神經(jīng)細(xì)胞的特異性抗體(神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE、膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP、半乳糖腦苷脂Gal-C)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新增殖能力和多向分化潛能。 2分別采用腦絡(luò)欣通藥物血清和左歸丸藥物血清培養(yǎng)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，觀察其促增殖效應(yīng)和誘導(dǎo)分化效應(yīng)，應(yīng)用相差顯微鏡和免疫熒光染色對其進(jìn)行比較觀察。 3線栓法制作急性局灶性腦缺血再灌注損傷動物模

3、型，動物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦絡(luò)欣通組及左歸丸組4組。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行腦缺血范圍測定和神經(jīng)缺損體征評分。在腦缺血再灌注1d、3d、7d后的3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)或免疫熒光化學(xué)技術(shù)，進(jìn)行Nestin、BrdU單標(biāo)染色及BrdU/GFAP、BrdU/NSE雙標(biāo)染色，分析比較各組大鼠腦組織中陽性細(xì)胞的表達(dá)情況。 4線栓法制作急性局灶性腦缺血再灌注損傷動物模型，動物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦絡(luò)欣通組及左歸丸組4組。在腦

4、缺血再灌注1d、3d、7d后的3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，進(jìn)行腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)免疫組化顯色，在大鼠腦缺血后腦內(nèi)有神經(jīng)干細(xì)胞增生的相關(guān)區(qū)域，分析比較腦缺血后以及應(yīng)用腦絡(luò)欣通和左歸丸后BDNF、bFGF的表達(dá)情況。 結(jié)果1從胎鼠大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下分離的組織，經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)均可形成細(xì)胞克隆，并具有增殖的能力，表達(dá)巢蛋白抗原和增殖細(xì)胞抗原；在血清誘導(dǎo)下，分化后的細(xì)胞表達(dá)3種神經(jīng)

5、細(xì)胞(神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)的特異性抗原。 2腦絡(luò)欣通藥物血清和左歸丸藥物血清均可誘導(dǎo)絕大多數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞；前者誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的進(jìn)程雖比后者要慢，但其分化的神經(jīng)元在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上與發(fā)育成熟的神經(jīng)元更為接近。此外，兩者還能一定程度上促進(jìn)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，以后者促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的效應(yīng)較為顯著。 3腦絡(luò)欣通組和左歸丸組均能縮小大鼠腦缺血范圍，改善神經(jīng)功能缺損體征，腦絡(luò)欣通

6、組作用強(qiáng)于左歸丸組。腦缺血再灌注損傷后，Nestin、BrdU在不同時(shí)間點(diǎn)、在缺血側(cè)的不同腦區(qū)出現(xiàn)程度不等的表達(dá)。與模型組比較，兩治療組Nestin、BrdU免疫陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，3d時(shí)左歸丸組促進(jìn)Nestin、BrdU表達(dá)的作用較腦絡(luò)欣通組顯著，1d、7d時(shí)兩組作用無明顯差異。兩治療組在3d時(shí)可見少量BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞，在7d時(shí)可見少量BrdU/NSE雙標(biāo)陽性細(xì)胞，雙標(biāo)陽性細(xì)胞率以腦絡(luò)欣通組為高。 4腦缺血再灌注損

7、傷后，在腦內(nèi)有神經(jīng)干細(xì)胞增殖的相關(guān)區(qū)域，BDNF表達(dá)范圍較廣泛，表達(dá)強(qiáng)度較強(qiáng)，表達(dá)峰值出現(xiàn)較晚；bFGF表達(dá)范圍較局限，表達(dá)強(qiáng)度較弱，表達(dá)峰值出現(xiàn)較早。與模型組比較，在給予腦絡(luò)欣通和左歸丸后，上述腦區(qū)內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)BDNF、bFGF的表達(dá)數(shù)量明顯增多、反應(yīng)明顯增強(qiáng)；兩治療組相比，前者促進(jìn)BDNF表達(dá)上調(diào)的效應(yīng)更為明顯，表達(dá)峰值出現(xiàn)較晚；后者以促進(jìn)bFGF表達(dá)上調(diào)的效應(yīng)顯著，其峰值出現(xiàn)較早。 結(jié)論腦絡(luò)欣通和左歸丸均能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞