鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)在肺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、癌癥是全人類所要面臨的主要的公共健康問題，目前盡管在減少癌癥發(fā)病率和死亡率、提高總生存上取得一些進(jìn)步，但癌癥依舊是超過心血管疾病的主要死亡原因。而支氣管-肺癌是男女新發(fā)病率排前三、死亡病率排第一的惡性疾病。
　　轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因，是惡性腫瘤最基本的特征。骨是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移最常見的部位之一，可導(dǎo)致難治性疼痛、高鈣血癥、神經(jīng)壓迫癥狀，甚至病理性骨折、截癱等，預(yù)示癌癥進(jìn)入不可治愈的階段，降低患者生活質(zhì)量、影響患者生存；約3

2、0～40％的肺癌患者會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。
　　包括化療、放療、核素治療、外科手術(shù)等對骨轉(zhuǎn)移的治療多屬姑息性治療，雙磷酸鹽類藥物是使用最廣的治療骨轉(zhuǎn)移癌的藥物，但不能促進(jìn)骨的形成；而且，在腫瘤患者治療要求的劑量下，雙磷酸鹽藥物有副作用，包括腎臟毒性及下頜骨壞死等等。臨床迫切需要開發(fā)新的防治腫瘤骨轉(zhuǎn)移的藥物和方法。但目前對骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制依舊不清楚，對關(guān)鍵的調(diào)控分子和通路了解不多。
　　我們課題組近5年一直從事肺癌骨轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，近期又

3、將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于肺癌骨轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究中，建立了人小細(xì)胞肺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SBC-5細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，通過比較分析具有相似遺傳背景、不同骨轉(zhuǎn)移潛能的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株SBC-5和SBC-3的蛋白質(zhì)表達(dá)，篩選出了一些差異表達(dá)蛋白，其中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）在骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SBC-5細(xì)胞中高表達(dá)；在臨床組織標(biāo)本中，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色我們發(fā)現(xiàn)CaNAα亞基（calcineurincatalyticsubunit,C

4、aNalpha）在具有骨轉(zhuǎn)移的小細(xì)胞肺癌組織中較不發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的小細(xì)胞肺癌高表達(dá)，而且細(xì)胞胞漿和胞核共表達(dá)，提示CaNAα與肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是目前唯一已知的細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)素依賴的絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶，在細(xì)胞信號傳遞過程中受鈣和鈣調(diào)蛋白的調(diào)節(jié)，主要催化磷脂酰絲氨酸和磷脂酰蘇氨酸脫磷酸化、活化T細(xì)胞核因子(NFAT)。大量研究表明CaN通過調(diào)節(jié)底物蛋白NFAT激活多條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、參與多種病理生理過程。近些年有

5、研究報道CaN-NFAT通路也參與了腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，抑制此通路可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的惡性表型。而關(guān)于CaN蛋白在肺癌嗜骨轉(zhuǎn)移中的作用研究是個空白。
　　目的
　　本課題主要研究肺癌細(xì)胞中CaNAα在體內(nèi)外的功能，證明CaN是一種新的肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)分子，在肺癌嗜骨轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步完善肺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床肺癌骨轉(zhuǎn)移的防治提供靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
　　方法
　　構(gòu)建并包裝人CaNAαRNAi慢病毒載體P

6、PP3CA-RNAi-LV、獲得CaNAα穩(wěn)定下調(diào)表型的LV-CnAα-RNAi-SBC-5細(xì)胞，通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測其增殖、克隆形成、凋亡、周期進(jìn)程、侵襲與轉(zhuǎn)移等表型改變，在經(jīng)尾靜脈接種NOD-SCID鼠的多發(fā)骨轉(zhuǎn)移模型體內(nèi)觀察對骨轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果
　　1．成功構(gòu)建人CaNAαRNAi表達(dá)載體pGCSIL-PUR-shRNA3，經(jīng)real-timePCR、WesternBlot驗(yàn)證其對SBC-5細(xì)胞CnAαmRNA

7、抑制率達(dá)70％、對CaNAαprotein的抑制率達(dá)95％（P<0.05）；
　　2．成功包裝pGCSIL-PUR-shRNA3質(zhì)粒的慢病毒PPP3CA-RNAi-LV及無關(guān)對照序列慢病毒NC-LV，經(jīng)純化、滴定濃度分別為1×109TU/ml、2×109TU/ml；
　　3．病毒成功感染細(xì)胞，獲得穩(wěn)定下調(diào)CaNAα表型的細(xì)胞PPP3CA-RNAi-LV-SBC-5及對照細(xì)胞NC-Puromycin-LV-SBC-5；

8、　　4．體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：下調(diào)CaNAα后抑制了SBC-5細(xì)胞的增殖、克隆形成(P=0.00009)、侵襲(p=0.0002)與轉(zhuǎn)移能力（p=0.002）、阻滯了細(xì)胞的G1-S進(jìn)程（PG1=0.02，Ps=0.000004）；但沒有影響細(xì)胞的凋亡率（P=0.34）；
　　5．應(yīng)用NOD-SCID鼠在國內(nèi)成功復(fù)制了既往國際上經(jīng)尾靜脈接種SCID鼠，建立的小細(xì)胞肺癌多發(fā)骨轉(zhuǎn)移模型，簡化了方法，節(jié)約了成本，為腫瘤研究提供了極好移植瘤動