殼聚糖介導(dǎo)RNA干擾技術(shù)靶向cyclin D1基因?qū)562細(xì)胞抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是最近發(fā)展的一種封閉基因表達(dá)的有效方法，其通過(guò)將雙鏈RNA(doublestrandRNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞中，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生有活性的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，與該段RNA同源的mRNA產(chǎn)生特異性降解，從而導(dǎo)致特異基因表達(dá)抑制的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)。許

2、多研究表明在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用RNAi能高效抑制內(nèi)源性和外源性基因的表達(dá)，因此應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制某一異?；虮磉_(dá)將可能用于病毒、腫瘤等疾病的治療。 基因治療是指通過(guò)有效的基因傳遞系統(tǒng)，將質(zhì)粒DNA(plasmidDNA，pDNA)插入到目的細(xì)胞中，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，最終將攜帶的基因信息傳遞給所連接的細(xì)胞中，從而達(dá)到基因治療的作用?；蛑委熤幸粋€(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是如何選擇合適的基因遞送載體，尋找對(duì)病變組織有選擇性、高效率且低毒的載體，以協(xié)助目的

3、基因進(jìn)入靶組織。目前，基因遞呈載體主要有病毒載體(viralvector)和非病毒載體(non-viralvector)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖是一種具有生物相容性和可生物降解的新型醫(yī)用生物材料，與病毒載體或其它非病毒載體相比，具有低廉、無(wú)感染性、缺乏免疫原性、無(wú)致突變以及便于臨床重復(fù)給藥等優(yōu)點(diǎn)，殼聚糖及其衍生物能與DNA形成聚電解質(zhì)聚合物，是一種持久安全性和高效的陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)移運(yùn)輸載體，具有良好的臨床應(yīng)用前景。 Cycl

4、inD1為G1期細(xì)胞周期素，與細(xì)胞周期素依賴(lài)激酶-4/6(Cyclindependentkinase4and6，CDK4/CDK6)結(jié)合而形成復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)編碼蛋白磷酸化，而與轉(zhuǎn)錄因子E2F分離，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，因而當(dāng)cyclinD1或CDK4/CDK6表達(dá)失控時(shí)，可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖周期失調(diào)。CyclinD1過(guò)表達(dá)可加速細(xì)胞進(jìn)入S期，使細(xì)胞G1期縮短，加速細(xì)胞增殖，使細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化。研究表明，許

5、多惡性腫瘤組織中都有cyclinD1的過(guò)表達(dá)。過(guò)表達(dá)的cyclinD1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)；并且與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物抗拒性有關(guān)。 本課題主要研究?jī)?nèi)容：通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建針對(duì)人cyclinD1基因的特異性小發(fā)夾RNA(smallhair-pinRNA，shRNA)真核表達(dá)載體，采用RNA干擾技術(shù)，運(yùn)用殼聚糖作為基因治療載體轉(zhuǎn)染人髓性白血病K562細(xì)胞，體外觀測(cè)其對(duì)cyclinD1基因的沉默作用以及RNAi后對(duì)K562