p38和JNK在缺氧誘導體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡中的作用.pdf

1、研究背景：缺血缺氧是眾多視網(wǎng)膜脈絡膜疾病的關鍵始發(fā)因素。缺氧不僅誘導視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞的增生，而且通過影響相關細胞因子(如VEGF、PEDF等)的分泌水平間接參與了眼底新生血管性疾病的發(fā)生發(fā)展。近十年來，缺氧下RPE細胞的相關研究已逐步成為學術界熱點之一。有研究表明，在多種眼底疾病中(年齡相關性黃斑變性(age related macular degeneration,AM

2、D)、遺傳性外層視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良和增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)等)均可觀察到RPE細胞凋亡，而且部分證實了凋亡參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。但人們對缺氧下RPE細胞凋亡的發(fā)生機制和特征卻了解甚少。
　　JNK和p38屬于絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinasea,MAPKs)家族，兩者通常由紫外線、滲透壓變化、細胞因子和生理激活因

3、素所啟動，又被稱作MAPK應激信號通路。已有證據(jù)表明ERK通路參與了RPE細胞的增生。對于大多數(shù)細胞來說，ERK1/2和JNK、p38在對細胞凋亡的調控中作用相反。因此有理由推測p38和JNK亦可能參與了缺氧導致的RPE細胞凋亡。
　　本研究旨在探討JNK和p38通路在缺氧誘導的RPE凋亡中的調控作用，為臨床防治缺血缺氧性眼內(nèi)疾病提供實驗依據(jù)。
　　目的：觀察p38和JNK信號通路在缺氧誘導的體外培養(yǎng)人RPE細胞凋亡中可能的

4、調控作用。
　　方法：
　　(1)將培養(yǎng)的人RPE細胞置于含體積分數(shù)為1％O2、5％CO2和94％N2的培養(yǎng)箱內(nèi)建立缺氧模型。于缺氧后1、3、6、12和24h，用光鏡、掃描電鏡、Annexin-V-FITC/PI染色流式細胞術(FCM)及TUNEL法檢測凋亡，于缺氧后1、2、3和4d后用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測RPE細胞的增生。
　　(2)于缺氧后1，3，6，12和24h，用Western blot檢測RPE

5、細胞內(nèi)p38蛋白的表達；以及用免疫組化及免疫熒光觀察p38和p-p38蛋白在RPE細胞內(nèi)的定位。用p38途徑抑制劑預處理RPE細胞30分鐘后置于缺氧孵箱內(nèi)培養(yǎng)3小時。Western blot檢測p38信號阻斷前后RPE細胞內(nèi)p38蛋白的表達。
　　(3)用p38通路抑制劑SB203580和JNK通路抑制劑SP600125預處理RPE細胞30分鐘，將RPE細胞置于缺氧孵箱內(nèi)培養(yǎng)3小時。用光鏡、透射電鏡、FCM及TUNEL法檢測對細胞

6、凋亡的影響；用MTT比色法檢測抑制劑對細胞增生的影響。
　　結果：
　　(1)缺氧可致RPE細胞凋亡，凋亡細胞數(shù)隨缺氧時間延長而增加(P<0.01)，在3小時達高峰；MTT顯示，缺氧處理后的RPE細胞增生較快，缺氧后2、3和4d時，缺氧組較對照組A值顯著增大(P<0.01)。
　　(2)Western blot顯示缺氧1、3、6、12和24h時，均有磷酸化p38蛋白表達，3h水平最高，持續(xù)至24h。經(jīng)p38抑制劑處理后

7、細胞中磷酸化p38蛋白水平降低，表明SB203580能有效抑制p38的磷酸化；免疫組化顯示，常氧狀態(tài)下p38蛋白在RPE細胞胞漿和胞核中均有分布。缺氧后，細胞漿內(nèi)棕色強度減弱，胞核顏色明顯加深，提示p38蛋白由胞漿向胞核內(nèi)轉位。免疫熒光證實，常氧條件下p-p38蛋白熒光僅在RPE細胞胞漿內(nèi)有微量表達，胞核內(nèi)無表達。隨缺氧時間的延長，p38蛋白的磷酸化水平逐漸增高，細胞核熒光強度明顯增強，至3h表達最強，24h開始下降。
　　(3)

8、缺氧3小時時RPE細胞凋亡明顯；經(jīng)p38和JNK抑制劑處理的細胞凋亡水平明顯下降(P<0.01)；MTT未顯示抑制劑對細胞增生有影響(P>0.05)。
　　結論：缺氧不僅能誘導RPE細胞增生，亦能誘導凋亡。p38和JNK轉導通路參與了缺氧誘導人RPE細胞的凋亡。通過本課題的初步研究，有理由推測缺氧通過激活p38和JNK轉導途徑調控體外培養(yǎng)的人RPE細胞的凋亡。本研究為下一步通過信號轉導通路調控缺氧下RPE凋亡提供了試驗證據(jù)，亦為臨