JNK信號轉導通路在赭曲霉毒素A誘導體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞（HKC）凋亡中的作用.pdf

1、目的：赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OA)是自然界中的一種真菌毒素，主要由赭曲霉和青霉菌屬的某些菌株產生，廣泛存在于谷物和食品中，是一種具有致畸性、致突變性和致癌性的真菌毒素。目前己有研究表明，OA具有腎臟毒性、肝臟毒性和免疫毒性，尤其是其腎臟毒性比較明顯，主要表現為腎小管變形退化、進行性腎纖維化和腎功能的損害，被認為是巴爾干腎病和慢性間質性腎炎的主要病因之一。 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-termin

2、al kinase，JNK)信號轉導通路是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路之一，大量實驗提示JNK信號轉導通路可被細胞因子、生長因子、應激等多種因素激活，在細胞分化、細胞凋亡、應激反應以及多種人類疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關重要的作用。目前，有關OA腎毒性機理的研究多集中在OA和DNA形成DNA加合物導致DNA的損傷、斷裂以及OA抑制線粒體的氧化呼吸鏈方面，而有關JNK信號轉導通路在OA誘導人腎小管上皮細胞(HKC)凋亡中作用

3、的研究未見報道。 鑒于此，本實驗采用細胞培養(yǎng)、MTT比色法、流式細胞定量檢測技術、免疫細胞化學、蛋白印跡等方法探討JNK信號轉導通路在OA誘導的人腎小管上皮細胞凋亡中的作用，揭示OA的腎毒性機制。 方法 1 細胞培養(yǎng)與處理HKC細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、10<'5>U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)，細胞貼壁生長。 選擇對數生長期的細胞(傳代后24h)隨機

4、分為空白對照組、溶劑對照組、OA處理組。OA處理組加入乙醇溶解液，終濃度為1μM和5μM，空白對照組加入生理鹽水，溶劑對照組加入乙醇(1：500)。常規(guī)消化、離心收集細胞，檢測各項指標。 2 噻唑藍(MTT)比色法2．1 MTT比色法用于檢測OA對細胞生長的影響。選擇對數生長期的細胞(傳代后24h)隨機分為四組：空白對照組、溶劑對照組、1μM和5μM OA處理組，每組6孔。在OA處理組中，分別給予上述細胞4h、8h、16h、24

5、h、48h的處理時間。根據MTT檢測結果，觀察OA處理對人腎小管上皮細胞HKC生長的影響，并依此篩選出最佳的處理時間，作為本實驗的處理時間。 2．2 選擇對數生長期的細胞隨機分為四組：空白對照組、溶劑對照組、1μMOA處理組和JNK阻斷劑組(JNK特異性阻斷劑-SP600125 0.5μM+OAlμM)，每組6孔。JNK阻斷劑組給予SP600125預處理30min后，再加入1μM OA處理細胞24h，觀察SP600125對OA作

6、用后HKC細胞存活率的影響。 3 流式細胞定量檢測技術(FCM)給予不同濃度OA處理后，FCM檢測人腎小管上皮細胞HKC細胞凋亡率。 4 免疫細胞化學(SP法)細胞爬片后，檢測OA處理后人腎小管上皮細胞HKC中凋亡相關蛋白caspase-3的表達以及JNK、p-JNK的表達情況。 5 蛋白免疫印跡(Western Blotting)提取細胞總蛋白，用蛋白印跡方法，檢測OA處理后人腎小管上皮細胞HKC中凋亡相關蛋白

7、caspase-3的表達情況及JNK、p-JNK的表達情況。 結果 1 OA對體外培養(yǎng)HKC細胞生長的影響MTT檢測結果表明，OA對HKC細胞的生長有一定抑制作用：給予1μM、5μMOA分別處理4h、8h、16h、24h、48h后，各時間點HKC細胞存活率均較對照組(100％)降低，尤其以24h OA處理組細胞的存活率降低更明顯(P<0.05)，1μM、5μNOA處理24h細胞存活率分別為51.09％，53.38％。根據

8、MTT檢測結果，選擇24h作為本研究的處理時間。 2 OA對體外培養(yǎng)HKC細胞凋亡的影響2.1 FCM檢測細胞凋亡率FCM DNA定量檢測結果顯示，HKC細胞經OA處理24h后，1μM、5μMOA處理組細胞凋亡率分別為3.85±0.29％和4.86±0.51％，均高于對照組(1.23±0.05％)(P<0.05)。 2.2 凋亡相關蛋白-Caspase-3的表達2.2.1 免疫細胞化學染色檢測Caspase-3蛋白表達C

9、aspase-3蛋白陽性染色為棕黃色顆粒，定位于HKC細胞胞漿內。免疫細胞化學染色可見，1μM和5μM OA處理組Caspase-3陽性細胞表達率分別為54.03±9.21％、60.75±9.95％，較對照組(14.31±4.24％)顯著增加(P<0.05)。 2.2.2 蛋白免疫印跡檢測Caspase-3蛋白表達Caspase-3蛋白分子量為32kD，經SDS-PAGE電泳、轉膜后，空白對照組、溶劑對照組、OA處理組均在32kD位置出

10、現了棕色的陽性條帶。以β-aetin(42KD)作為內參照，采用圖像分析系統(tǒng)對雜交條帶進行定量分析，結果表明，OA處理可以誘導體外培養(yǎng)HKC細胞Caspase-3蛋白表達。 3 OA對體外培養(yǎng)HKC細胞磷酸化JNK(p-JNK)表達的影響。3.1 免疫細胞化學染色檢測p-JNK的表達p-JNK定位于HKC細胞胞漿和胞核內。免疫細胞化學染色可見，1μM、5μM OA處理組p-JNK陽性細胞表達率分別為53.31±11.01％和58

11、.53±11.11％，明顯高于對照組(10.19±6.85％)(P<0.05) 3.2 蛋白免疫印跡檢測p-JNK的表達p-JNK是JNK的活化形式，由p-JNK1、p-JNK2、p-JNK3組成。p-JNK1蛋白分子量為54kD；p-JNK2、p-JNK3蛋白分子量為46kD，經SDS-PAGE電泳、轉膜后，HKC細胞空白對照組、溶劑對照組、OA處理組均在54kD、46kD位置出現了兩條棕色的陽性條帶。經圖像分析系統(tǒng)對雜交條帶

12、進行定量分析，結果表明，OA處理可以使HKC細胞p-JNK表達增高。 4 OA對體外培養(yǎng)HKC細胞JNK表達的影響。4.1 免疫細胞化學染色檢測JNK的表達JNK定位于HKC細胞胞漿內。免疫細胞化學染色可見，與對照組相比，1μM和5μM OA處理組JNK陽性細胞表達率無明顯變化(P>0．05)。 4．2 蛋白免疫印跡檢測JNK的表達JNK由JNK1、JNK2、JNK3組成，JNK1蛋白分子量為54kD，JNK2、JNK3蛋白分子

13、量為46kD。經SDS-PAGE電泳、轉膜后，HKC細胞對照組、OA處理組均在54kD、46kD位置出現了棕色的陽性條帶。經圖像分析系統(tǒng)對雜交條帶進行定量分析，進一步證實給予OA處理后，體外培養(yǎng)的HKC細胞JNK的表達無明顯變化。 5 JNK特異性阻斷劑-SP600125對OA處理后HKC細胞存活率的影響MTT檢測結果發(fā)現，JNK阻斷劑組(SP600125預處理+OA)HKC細胞的存活率(82.09％)明顯高于OA處理組66.8

14、3％(P<0.05)，但低于溶劑對照組(98.58％)(P<0.05)，說明SP600125對OA致HKC細胞損傷具有部分阻斷作用，提示OA可能通過JNK信號轉導通路參與介導細胞死亡的過程。 結論 1 OA可以促進體外培養(yǎng)HKC細胞Caspase-3蛋白的表達，誘導細胞凋亡。 2 OA可以促進體外培養(yǎng)HKC細胞p-JNK的表達，提示JNK信號轉導通路可能參與OA誘導的HKC細胞凋亡。 3 SP600125