酸性橙Ⅱ單克隆抗體的制備及其ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、酸性橙Ⅱ(Acid OrangeⅡ，AOⅡ)是一種化工染料，主要作為紡織品、皮革制品、塑料及木制品的染色劑，也可在醫(yī)學(xué)上用于組織染色。因其色澤艷麗、易于著色，常有商販非法將其用于食品著色。有研究證實(shí)酸性橙Ⅱ有一定的致畸作用和致癌性，在食品加工中使用，可能引起食物中毒，長(zhǎng)期食用甚至?xí)掳?，因此?yán)禁將其作為食品添加劑使用。國(guó)家衛(wèi)生部2011年發(fā)布的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單中，明確規(guī)定禁止在食品中添加酸性橙Ⅱ。
　　文獻(xiàn)報(bào)道的

2、對(duì)食品中酸性橙Ⅱ的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、反高效液相色譜法、超高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、熒光光譜法、電化學(xué)分析法等，這些方法需要的儀器設(shè)備貴重、樣品處理過(guò)程更為復(fù)雜并要有專(zhuān)門(mén)的相關(guān)技術(shù)人員，難以滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而免疫學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單易于攜帶，檢測(cè)效率高，適合對(duì)大批量樣品作現(xiàn)場(chǎng)快速篩選。目前僅有少數(shù)針對(duì)酸性橙Ⅱ的多克隆抗體，其免疫分析方法的特異性較低，效果較單克隆抗體差很多。
　　本實(shí)驗(yàn)采用琥珀酸酐法

3、和鹵代羧酸法合成了酸性橙Ⅱ完全抗原，經(jīng)過(guò)透析、鑒定后獲得免疫原和包被原。用合成的免疫原分批免疫BALB/c小鼠，利用單克隆抗體技術(shù)、ELISA檢測(cè)法及小鼠腹水制備等技術(shù)，制備出針對(duì)酸性橙Ⅱ特異性強(qiáng)、效價(jià)高的單克隆抗體，并建立ELISA檢測(cè)方法。
　　1.AOⅡ完全抗原的合成與鑒定
　　酸性橙Ⅱ分子結(jié)構(gòu)中沒(méi)有能夠直接與蛋白進(jìn)行偶聯(lián)的基團(tuán)，分別采用一氯醋酸鈉法和琥珀酸酐法對(duì)酸性橙Ⅱ中的酚羥基進(jìn)行修飾，連接上帶有羧基的間隔臂，再經(jīng)

4、活性脂法(NHS)與載體蛋白偶聯(lián)，成功制備出酸性橙Ⅱ的免疫原和包被原。經(jīng)紫外光譜掃描和SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，可初步判定人工抗原偶聯(lián)成功。經(jīng)動(dòng)物免疫和ELISA測(cè)定，均檢測(cè)到產(chǎn)生抗體，表明兩種抗原的制備是成功的。利用BCA試劑盒測(cè)得AOⅡ-BSA和AOⅡ-OVA的蛋白濃度分別為2.35mg/mL和1.60mg/mL; AOⅡ-BSA(B)和AOⅡ-OVA(B)的蛋白濃度分別為4.12mg/mL和3.11 mg/mL。
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5、.AOⅡ單抗的制備
　　以合成的人工抗原AOⅡ-BSA、AOⅡ-BSA(B)作為免疫原，按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)免疫程序免疫BALB/c小鼠（方法A合成的免疫2只，方法B合成的免疫3只）。以AOⅡ-OVA和AOⅡ-OVA(B)分別做包被原，五免后7d小鼠剪尾采血，測(cè)血清效價(jià)及抑制情況，血清效價(jià)達(dá)1∶16000以上。經(jīng)細(xì)胞融合、ELISA篩選和有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，最終獲得三株可持續(xù)分泌針對(duì)AOⅡ抗體的雜交瘤細(xì)胞株4D3、4F10和7E10。

6、利用小鼠體內(nèi)誘生法制備出抗AOⅡ單克隆抗體的腹水，其中4F10效價(jià)最好達(dá)96000，蛋白濃度為20.4 mg/mL。腹水4F10經(jīng)純化后SDS-PAGE凝膠鑒定雜蛋白明顯減少。交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該單抗與堿性黃、莧菜紅、蘇丹紅Ⅰ、副品紅、羅丹明B、胭脂紅、檸檬黃、日落黃沒(méi)有交叉反應(yīng)，而對(duì)酸性橙Ⅱ的抑制率達(dá)100％。
　　3.ELISA檢測(cè)方法的建立
　　用純化后的4F10單克隆抗體建立檢測(cè)AOⅡ的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，包被原

7、最佳稀釋濃度1∶4000，純化后抗體的最佳工作濃度1∶24000，AOⅡ濃度在20～2000ng/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性良好，線(xiàn)性方程為y=0.3363x-0.2732(R2=0.989)，IC50為198.13ng/mL，LOD低于16.69ng/mL，LOQ為52.22ng/mL。
　　4.鹵肉中AOⅡ添加回收試驗(yàn)
　　鹵肉樣品添加回收實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)測(cè)定前先對(duì)鹵肉樣品進(jìn)行前處理。將樣品處理液稀釋16倍以上時(shí)，可基本消除樣品的基