SSEA-3，SSEA-4在乳腺癌中表達(dá)的實驗研究.pdf

1、背景與目的:
　　 近年來隨著干細(xì)胞認(rèn)識的深入及生物實驗技術(shù)的進(jìn)步,干細(xì)胞研究已幾乎涉及到所有的生命科學(xué)和生物醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域。胚胎干細(xì)胞更是由于其廣闊的應(yīng)用前景而倍受科學(xué)界的關(guān)注。階段特異性胚胎抗原(stage specific embryonicantigen,SSEA)因為其在胚胎干細(xì)胞的分離、鑒定中的普遍應(yīng)用也引起人們的廣泛關(guān)注。由于在最初發(fā)現(xiàn)時,SSEA是特異性地表達(dá)于哺乳動物胚胎發(fā)育的特定階段而得名。目前,這些抗原都是通

2、過相應(yīng)的單克隆抗體作為探針鑒別發(fā)現(xiàn)的,并且按照它們被發(fā)現(xiàn)的先后順序?qū)⑵湟来蚊麨镾SEA-1、SSEA-3和SSEA-4。SSEA-1也稱為LeX或CD15,由于它在動物組織中分布的廣泛性引起了科學(xué)界較多的關(guān)注,因此目前對這一抗原的研究相對來說比較多。我們知道胚胎細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的分裂速度比成熟組織要快很多,且當(dāng)正常組織發(fā)生癌變時,經(jīng)常伴隨著胚胎抗原的出現(xiàn),這是否也同SSEA等表面抗原的表達(dá)有關(guān),現(xiàn)在還仍是疑問。在SSEA-3或SSEA-

3、4的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)巖藻糖基化、唾液酸化就可形成LeX或SLeX,但是SSEA-3和SSEA-4除在動物胚胎組織中的研究外,目前在成體組織及腫瘤組織中國內(nèi)對它們的研究甚少,在乳腺組織中的研究更是幾乎空白。進(jìn)行這方面的研究有助于我們了解胚胎抗原與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,并且進(jìn)一步深化我們對腫瘤的發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識。
　　 已有研究表明SSEA-1在部分惡性腫瘤中有表達(dá),并且其甚至與某些惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移等行為有一定的相關(guān)性。在胚胎發(fā)育過程中首先

4、出現(xiàn)的是SSEA-3和SSEA-4,后才出現(xiàn)SSEA-1。到底SSEA-3和SSEA-4是否也同LeX或SLeX一樣參與某些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程,以及其是通過什么樣的方式參與該過程尚有待于研究。就國內(nèi)SSEA-3,4在乳腺癌中的研究報道尚少的現(xiàn)狀,本研究主要從乳腺組織及細(xì)胞系兩個層面采用免疫組織/細(xì)胞化染色法對SSEA-3及SSEA-4在乳腺正常組織、乳腺良性病變組織、乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB468中的表達(dá)分布情況進(jìn)行研

5、究。旨在探討其與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性,借此給乳腺癌的基礎(chǔ)研究及臨床治療提供一定的參考。
　　 材料與方法:
　　 1.材料:組織標(biāo)本與細(xì)胞系
　　 1.1組織標(biāo)本:50例乳腺癌,50例乳腺良性病變及20例乳腺正常組織標(biāo)本均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2006年8月至2007年4月手術(shù)標(biāo)本。并經(jīng)兩位資深病理學(xué)家復(fù)查確診。
　　 1.2細(xì)胞系:人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB468采用10％特級新生小牛血清-DMEM培養(yǎng)

6、基(GIBCO/BRL、高糖),0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶的1:1混合液消化,傳代,在37℃、5％CO2飽和濕度條件下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。實驗均選用對數(shù)生長期細(xì)胞(長滿80％)。
　　 2.方法
　　 2.1組織標(biāo)本切片后采用免疫組織化學(xué)SP法檢測SSEA-3和SSEA-4抗原的表達(dá)情況。
　　 2.2選四代對數(shù)生長期的細(xì)胞做細(xì)胞爬片；用4％多聚甲醛置于4度冰箱中固定30分鐘；采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測SS

7、EA-3和SSEA-4的表達(dá)情況(SP法同上)。
　　 2.3評分方法:陽性標(biāo)記強(qiáng)度特征,依照細(xì)胞陽性著色程度(抗原含量)可分為以下四個等級:陰性；弱陽性(+)…1分；中等陽性(++)…2分；強(qiáng)陽性(+++)…3分；陽性分布范圍,依照陽性細(xì)胞數(shù)可分以下四個等級:陰性；弱陽性(+)陽性細(xì)胞數(shù)在25％以下…1分；中等陽性(++)細(xì)胞數(shù)在25％-49％…2分；強(qiáng)陽性(卅)陽性細(xì)胞數(shù)在50％以上…3分。采用積分綜合計量公式計算以上兩評分

8、的乘積<3者為陰性,>4者為陽性,>6者為強(qiáng)陽性,觀察5個高倍鏡視野(HP.)取其平均。
　　 2.4統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0處理,統(tǒng)計方法采用X2檢驗。當(dāng)P<0.05時,認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.SSEA-3及SSEA-4在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB468中的表達(dá)結(jié)果SSEA-3及SSEA-4兩個抗原均可見有較高的陽性表達(dá)率,平均>90％。
　　 2 SSEA-

9、3在組織切片中的表達(dá)結(jié)果
　　 2.1 SSEA-3在乳腺癌、乳腺良性病變標(biāo)本中均有陽性表達(dá)。
　　 2.2 SSEA-3在乳腺癌、乳腺良性病變標(biāo)本中的陽性表達(dá)率分別為34％(17/50)、16％(8/50),且其在ER+乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá)陽性率較高(P<0.05)。
　　 2.3 SSEA-3在乳腺正常組織中檢測不到陽性表達(dá)結(jié)果。
　　 3 SSEA-4在組織切片中的表達(dá)結(jié)果
　　 3.1 SS

10、EA-4在乳腺癌、乳腺良性病變標(biāo)本中均有陽性表達(dá)。
　　 3.2 SSEA-4在乳腺癌、乳腺良性病變標(biāo)本中的陽性表達(dá)率分別為58％(29/50)、36％(18/50),其在乳腺癌中的表達(dá)與標(biāo)本ER.無明顯相關(guān)性(P>0.05)。
　　 3.3 SSEA-4在乳腺正常組織標(biāo)本中未見陽性表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 SSEA-3及SSEA-4抗原在乳腺癌及乳腺良性病變組織中均有表達(dá),且其表達(dá)分布特點(diǎn)具有明顯的區(qū)

11、別:SSEA-3和SSEA-4在乳腺癌中的表達(dá)較之在乳腺良性病變中的表達(dá)陽性率均要高(P<0.05),而在正常乳腺組織中這兩個抗原均未見有陽性表達(dá)。因此,推測這兩個抗原可能與乳腺癌的發(fā)生有相關(guān)性,在乳腺癌組織中其表達(dá)會相應(yīng)的增多,這給我們對乳腺癌的研究提供了新的方向,并且提示我們對這類抗原與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等的具體相關(guān)關(guān)系進(jìn)行研究是有必要的。
　　 另外,SSEA-3和SSEA-4在乳腺癌中可見有陽性表達(dá),陽性率分別為34

12、％(17/50)和58％(29/50),且其在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)陽性率也較高,而在正常乳腺組織中未見陽性表達(dá)。考慮到其在乳腺癌及其正常組織有限的表達(dá)分布,可以推測這類抗原可能作為一種潛在的碳水化合物為基礎(chǔ)的乳腺癌疫苗的候選抗原,為改善乳腺癌的治療和預(yù)后提供新的希望。
　　 我們的實驗還發(fā)現(xiàn)SSEA-3在乳腺癌中的表達(dá)與其ER有正向相關(guān)關(guān)系,而SSEA-4的表達(dá)無此特性。
　　 已有研究表明在胚胎發(fā)育時期SSEA-3及SS