IRF-4結(jié)合蛋白(IBP)在乳腺癌中表達(dá)及功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌已經(jīng)成為僅次于肺癌的威脅人類健康的主要惡性疾病之一。盡管隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步乳腺癌患者5年和10年生存率分別提高到70％和50％，但仍有約40％左右的患者死于腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。最近的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的首要條件是形成稱為“樹突狀偽足”的突起，這種“突起”中具備含有蛋白酶的囊性結(jié)構(gòu)，通過(guò)這種囊性結(jié)構(gòu)與腫瘤細(xì)胞膜的融合，釋放蛋白酶降解包圍它們的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自原發(fā)灶逃脫。IBP是在人免疫系統(tǒng)中大量表達(dá)并具有重要功能的蛋白質(zhì)

2、，它參與TCR信號(hào)刺激下T細(xì)胞免疫突觸的形成；與Th2細(xì)胞的分化關(guān)系密切：通過(guò)抑制IRF-4的轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)控介素17與介素21的產(chǎn)生，影響Th17細(xì)胞的功能；影響MAPKs與NF-κB參與TLRs傳導(dǎo)通路；對(duì)維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用，IBP knockout小鼠表現(xiàn)為自身免疫免疫性疾病的癥狀并對(duì)致死性LPS產(chǎn)生抵抗。除此之外，IBP具有鳥苷酸交換因子(GEF)的作用，能夠激活Rho GTPase家族的部分成員。所有這些研究結(jié)果

3、均提示IBP可以參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)、細(xì)胞極化、細(xì)胞間的信息傳遞等多種重要生理過(guò)程，然而，由于缺乏特異性抗IBP抗體，目前對(duì)IBP在人體其它組織(尤其是腫瘤)中的表達(dá)及功能的研究較少。 本課題以乳腺癌為研究對(duì)象，對(duì)IBP在乳腺癌中的表達(dá)及其可能的臨床意義進(jìn)行研究，并通過(guò)體外試驗(yàn)證實(shí)IBP在乳腺癌中的功能及其可能的機(jī)制，研究主要從三個(gè)方面進(jìn)行： 一、特異性抗IBP單克隆抗體的制備及鑒定 如前所述，目前對(duì)IBP異位表達(dá)

4、和功能研究較少，文獻(xiàn)中缺少相關(guān)的研究線索，為此，我們通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)IBP的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，選擇其抗原性強(qiáng)的特異區(qū)域進(jìn)行重組表達(dá)，免疫BALB/C小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合及篩選成功獲得多株抗IBP單克隆抗體。進(jìn)一步通過(guò)ELISA、WB、IHC、ICC等實(shí)驗(yàn)，確定能夠滿足多種實(shí)驗(yàn)需要的表位特異性抗IBP單克隆抗體。 二、IBP在乳腺癌中表達(dá)及其臨床意義的研究 1.利用MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、

5、MDA-MB-453、MDA-MB-468、SK-BR-3等多株乳腺癌細(xì)胞株通過(guò)WB及RT-PCR技術(shù)分析IBP的表達(dá)情況； 2.通過(guò)雙重免疫熒光染色確定IBP在乳腺癌中的表達(dá)模式主要位于胞膜及胞漿； 3.收集了107例不同臨床分級(jí)的臨床乳腺癌標(biāo)本構(gòu)建組織芯片； 4.通過(guò)免疫組化染色對(duì)IBP在臨床樣本中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，與臨床樣本的其它病理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定其臨床意義。 三、IBP在乳腺癌中的功能

6、及其機(jī)制的研究 1.利用IBP表達(dá)陰性的MDA-MB-435細(xì)胞，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建IBP過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，利用IBP表達(dá)陽(yáng)性的MDA-MB-231細(xì)胞，通過(guò)RNAi的方法構(gòu)建IBP低表達(dá)細(xì)胞模型； 2.通過(guò)MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況的差異，判斷IBP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響； 3.利用Transwell試驗(yàn)，經(jīng)穿膜細(xì)胞染色計(jì)數(shù)研究各組細(xì)胞侵襲能力，確定IBP對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響； 4.以臨床常用的乳腺癌治療藥物紫

7、杉醇為誘導(dǎo)劑，觀察IBP的表達(dá)對(duì)細(xì)胞耐受紫杉醇?xì)芰Φ挠绊懀?5.通過(guò)細(xì)胞骨架染色觀察IBP與細(xì)胞骨架的關(guān)系，通過(guò)免疫熒光確定IBP與粘著斑形成的關(guān)系； 6.通過(guò)雙重免疫熒光染色與IP確定IBP與Raclb間的關(guān)系。 主要研究結(jié)果如下： 1.經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，明確了IBP蛋白的一些可能的分子特征：非分泌蛋白；具有與胞膜及Actin結(jié)合的潛能；具備多個(gè)磷酸化位點(diǎn)；除已經(jīng)明確具有重要功能的PH及DH結(jié)構(gòu)域

8、外其N端及C端還存在可能與其功能關(guān)系密切的結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)IBP蛋白二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，確認(rèn)IBP410-488符合抗體制備中對(duì)表位的要求，通過(guò)重組表達(dá)該片段經(jīng)融合和對(duì)融合后的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行ELISA及WB篩選，獲得7株(A2，A9，C6，D5，F(xiàn)5，G3，與G4)分泌特異性抗IBP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)IHC分析，其中5株(A2，A9，C6，D5與F5)細(xì)胞所分泌的抗體可應(yīng)用于IHC對(duì)IBP的檢測(cè)，而A9，C6與D5三株抗體

9、IHC染色最強(qiáng)； 2.WB與RT-PCR證實(shí)IBP選擇性表達(dá)于MCF-7、MDA-MB-231及SK-BR-3細(xì)胞，經(jīng)IBP與DiI雙重染色確定乳腺癌中的IBP主要表達(dá)與胞膜與胞漿； 3.收集了107例臨床乳腺癌手術(shù)組織(73例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，34例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，利用組織芯片技術(shù)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，通過(guò)分析，我們?cè)谡Ｈ橄偌叭橄倭夹圆∽冎形匆奍BP表達(dá)，而有57例乳腺癌患者病理切片中IBP表達(dá)陽(yáng)性(陽(yáng)性率53.3％)，經(jīng)

10、進(jìn)一步與其它指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)IBP的表達(dá)與乳腺癌的病理分級(jí)(p=0.005<0.01)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(p=0.003<0.01)，與P53的表達(dá)負(fù)相關(guān)(p=0.026<0.05)； 4.經(jīng)MTT、Transwell等試驗(yàn)證實(shí)IBP有促進(jìn)乳腺癌增殖、侵襲的作用，在一定程度上還具有紫杉醇抗藥性。 5.IBP過(guò)表達(dá)MDA-MB-435細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，偽足生成明顯增多，而RNAi致IBP低表達(dá)MDA-MB-

11、231細(xì)胞偽足生成減少。通過(guò)細(xì)胞骨架染色發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)IBP與微管及微絲均存在共定位而與后者共定位程度更為明顯，其定位位置主要位于粘著斑，IBP的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)中間絲的成分之一波形蛋白的表達(dá)上調(diào)，而波形蛋白本身即是腫瘤惡性度及轉(zhuǎn)移性上升的標(biāo)志。 6.雙重免疫熒光染色及IP證實(shí)IBP與Raclb具有協(xié)同作用，能夠促進(jìn)Raclb所致的上皮-基質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(波形蛋白上調(diào))的發(fā)生。 綜上所述，除免疫系統(tǒng)外，IBP在乳腺癌中也存在相當(dāng)程度

12、的表達(dá)，該表達(dá)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；乳腺癌中IBP的表達(dá)具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲的作用，而其促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制在于IBP不但可以促進(jìn)細(xì)胞偽足的形成，參與粘著斑的構(gòu)成提高細(xì)胞的遷移能力，還能通過(guò)與Raclb的協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，從而使細(xì)胞能夠突破基底層實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。本課題嘗試把乳腺癌轉(zhuǎn)移的兩個(gè)首要條件偽足形成與基底膜破壞聯(lián)系起來(lái)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)IBP與這二者均具有密切關(guān)系，可能是二者的橋梁。上述研究成果對(duì)進(jìn)一步完