靶向蛋白激酶Aurora A的抗腫瘤藥物篩選模型的建立和評(píng)價(jià).pdf

1、蛋白激酶是一類能夠?qū)⑾掠蔚孜锪姿峄牡鞍祝煞譃榻z/蘇氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶。蛋白磷酸化作用在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用。其作為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素在腫瘤形成的各個(gè)方面，如增殖、侵入、轉(zhuǎn)移、血管新生等，都發(fā)揮重要的作用。隨著腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的揭示，一些在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的蛋白激酶已經(jīng)成為篩選抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)，蛋白激酶抑制劑也成為近年來抗腫瘤藥物開發(fā)研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)有一些蛋白激酶抑制劑投放市場(chǎng)，還有數(shù)目眾多的蛋白

2、激酶抑制劑處于臨床前和臨床研究階段。 Aurora A是絲/蘇氨酸蛋白激酶Aurora家族成員之一，其定位于中心體和紡錘體附近，在細(xì)胞有絲分裂中主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)中心體成熟、紡錘體組裝，促進(jìn)有絲分裂啟動(dòng)以及促進(jìn)核膜破裂。Aurora A在多種腫瘤組織中均高表達(dá)，其高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)生，同時(shí)與某些腫瘤的預(yù)后相關(guān)。近年來，Aurora激酶抑制劑作為抗腫瘤候選藥物受到廣泛的關(guān)注，已有一些處于臨床研究中，且表現(xiàn)出良好的抗腫瘤

3、活性。 本論文研究的目的是擬在分子水平和細(xì)胞水平建立蛋白激酶抑制劑的篩選模型，可用于后續(xù)抗腫瘤藥物的篩選工作。 一方面，在分子水平體外利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)體系表達(dá)Aurora A蛋白激酶，用Ni-NTA柱對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。再用考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot方法對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：得到了Aurora A的重組蛋白?；跓晒馄竦姆椒?，摸索各種重要因素酶用量、ATP和底物的條件，確定了相應(yīng)的濃度

4、。同時(shí)用陽性化合物Aurora kinase inbibitor II對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，在分子水平成功建立了蛋白激酶Aurora A的抑制劑篩選模型。 另一方面，在細(xì)胞水平，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV包裝病毒，進(jìn)而感染宿主細(xì)胞HEK293，得到穩(wěn)定的Aurora A高表達(dá)細(xì)胞株，應(yīng)用RT-PCR和Westernblot方法，從基因水平和蛋白水平對(duì)高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。結(jié)果證明高表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功，可用于對(duì)分子水平篩選得到的化合物