靶向蛋白激酶IKKβ和mTOR的抗腫瘤藥物分子水平篩選模型的建立.pdf

1、長期以來，炎癥一直被認為和癌癥密切相關，因為反復發(fā)生的慢性炎癥和感染大大提高了腫瘤的發(fā)病率，但其中的具體分子機制仍未得到詳細闡述。近年來隨著研究的深入，逐漸認識到IκB激酶(Inhibitor of kappa B Kinase，IKK)復合物和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)在慢性炎癥導致癌癥發(fā)生過程中的重要作用。腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factorα

2、，TNFα)等配體的刺激下，IKKβ磷酸化IκBα(inhibitor of NF-κB)分子并誘導其降解，使NF-κB從IκBα-NF-κB復合體中解離后轉運至細胞核啟動下游基因的轉錄，調節(jié)腫瘤相關癌基因與抑癌基因的表達。而且IKKβ主要通過刺激炎癥因子的分泌在連接炎癥與腫瘤之間的橋梁中發(fā)揮關鍵作用，IKKβ過表達或活性增加可以有效刺激炎癥因子的分泌，如TNFα，IL-1，IL-6，IL-8，CSF-1和COX2等。炎癥因子通過調節(jié)腫

3、瘤細胞和間質細胞之間以及腫瘤細胞和細胞外基質之間的相互作用，改變了腫瘤細胞的生存微環(huán)境，內源性地促進腫瘤的生長、浸潤、擴散。作為多條信號通路的中心節(jié)點，mTOR通路通過廣泛的網絡效應影響腫瘤的生長和增殖。生長因子、有絲分裂原、能量、營養(yǎng)物質、細胞內壓力都通過對抑癌基因TSC1和TSC2的翻譯后修飾調控mTOR的活性；還有很多激酶，如Akt、Rsk1、Erk、Gsk、Cdk1、p38、Mk2和AMPK，都能作為TSC(Tuberoussc

4、lerosis protein)的激酶，調節(jié)TSC1/TSC2/mTOR通路，進而轉導胞外信號和介導腫瘤生成。尤為重要的是，炎性因子在其中也發(fā)揮著重要作用，如腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)分泌的TNFα、IL-1β可以通過mTOR介導的VEGF等細胞因子的表達促進腫瘤生成。另外，活化后的IKKβ還能磷酸化TSC1，改變TSC1的膜定位，阻礙其與TSC2之間的結合，消除TSC1-TS

5、C2復合物對mTOR的抑制作用，進而激活mTOR通路并促進下游VEGF表達。因此炎癥因子TNFα能夠激活mTOR通路，并且通過IKKβ介導的對TSC1的抑制作用促進腫瘤血管生成。所以，IKKβ和mTOR通路在炎癥與腫瘤之間搭建了一座橋梁，二者的作用不僅在一定程度上解釋了慢性炎癥和感染引發(fā)腫瘤的原因，更重要的是它們可作為預防和治療腫瘤潛在的新靶標，大大推進抗炎抗腫瘤藥物的開發(fā)。因為與傳統(tǒng)單純以腫瘤細胞為靶點的治療方法相比，同時針對腫瘤細胞

6、和炎癥細胞的治療方法不僅療效顯著提高，而且不易形成耐藥性，因為炎癥細胞的基因組相對穩(wěn)定，大大增加了藥物治療的特異性。
　　 本文以此作為出發(fā)點，利用分子生物學方法分別采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)和昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，進行IKKβ和mTOR外源蛋白表達，并對兩種表達體系產物的活性進行比較。最終采用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，分別構建IKKβ全長和mTOR激酶區(qū)截斷突變體mTOR-FKD的Bac-to-Bac供體質粒和穿

7、梭質粒，通過桿狀病毒感染昆蟲細胞表達具有組氨酸標簽的IKKβ和mTOR-FKD重組蛋白，經過親和層析得到純度較高、活性較好的目的蛋白。以激酶與底物及ATP的體外反應為基礎，采用固定變量法，逐一對激酶反應體系中ATP、底物和激酶的濃度進行優(yōu)化，并使用陽性抑制劑對篩選模型予以評價，確保篩選模型的穩(wěn)定、靈敏。使用基于生物發(fā)光原理的Kinase-GloLuminescent Kinase Assay分析方法，采用均質熒光素酶體系進行檢測，擬建立