靈芝氯仿萃取部位免疫調節(jié)及抗腫瘤作用的實驗研究.pdf

1、靈芝(Ganoderma)按中文發(fā)音拼成Lingzhi,按日文發(fā)音拼成Reishi,是幾種靈芝屬真菌的總稱,按中國藥典定義,主要指相互之間性狀非常接近的赤芝[Ganoderma lucidum(Leys.ex Fr.)Karst]和紫芝(Ganoderma sinense Zhao,Xu etZhang)。按照科學分類法,靈芝屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、多孔菌目、靈芝屬真菌。
　　 靈芝享譽東亞,尤其在傳統(tǒng)中醫(yī)里,靈芝作為藥用

2、的歷史已超過2000多年,是目前已知作為藥用最為古老的菌類之一。中國傳統(tǒng)觀念認為,靈芝具有益氣安神,扶正固本之功效,被視為珍貴的中藥材,是中醫(yī)藥寶庫中的珍品。
　　 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),靈芝具有多種功效,如:免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、護肝、降血糖、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、改善記憶等。在靈芝的有效成分中,多糖、三萜類和肽類被認為是主要有效成分,受到廣泛的關注。靈芝水提取物主要以多糖為主,靈芝醇提取物中含有多種有效成份,其中三萜類化合物含量較高,具有多

3、種生物活性。對靈芝醇提物或醇提活性部位的研究發(fā)現(xiàn),靈芝醇提物能改善記憶障礙模型動物的學習記憶能力,抑制小鼠腫瘤細胞的生長,抑制小鼠急性搔癢相關的反應等,靈芝三萜類化合物也具有抗腫瘤作用。然而靈芝醇提氯仿萃取部位作為一個整體對免疫功能的調節(jié)作用和抗腫瘤作用尚不十分清楚,本研究初步探討了靈芝氯仿萃取部位的免疫調節(jié)功能和抗腫瘤作用機制。
　　 目的
　　 1.制備靈芝氯仿萃取部位,即先用乙醇提取,醇提物再用氯仿萃取。
　

4、　 2.探討靈芝氯仿萃取部位體外對刀豆素A(ConA)誘導的小鼠脾細胞增殖反應的影響；對脂多糖(LPS)誘導的小鼠脾細胞增殖反應的影響；對正常小鼠單核/巨噬細胞吞噬功能、遲發(fā)型超敏反應(DTH)、血清溶血素水平的影響。
　　 3.探討靈芝氯仿萃取部位體內對環(huán)磷酰胺誘導免疫抑制小鼠的DTH、單核巨噬細胞吞噬功能、血清溶血素水平的影響。
　　 4.探討靈芝氯仿萃取部位體內對荷瘤小鼠單核/巨噬細胞吞噬功能、遲發(fā)型超敏反應(D

5、TH)、血清溶血素水平的影響。
　　 5.探討靈芝氯仿萃取部位體外對S180細胞增殖反應的影響；對體內荷S180實體瘤小鼠的抑瘤作用。
　　 方法
　　 1.稱取靈芝粗粉,加95％無水乙醇,70℃水浴回流1h,收集2次提取液,真空抽濾,50℃減壓濃縮后恒溫干燥,得棕色浸膏。將浸膏懸浮于水中,先后以石油醚、氯仿不同極性部位依次進行萃取,回收有機試劑,減壓干燥得到氯仿萃取部位。
　　 2.取正常小鼠脾細胞,加

6、入靈芝氯仿萃取部位,同時加入ConA或LPS刺激,在37℃下培養(yǎng)48h,用MTT比色法檢測ConA和LPS誘導的小鼠脾細胞的(增殖)代謝活力。
　　 3.正常小鼠50只,隨機分為5組,DMSO:橄欖油(1:9)對照組、陽性藥物(靈芝多糖200mg/kg)組、靈芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)組,小鼠分別連續(xù)灌胃溶媒或干預藥物7d。于給藥后第1日用1％二硝基氟苯(dinitro-fluorobenzene,DNFB

7、)腹部致敏,末次給藥后將1％DNFB涂抹于5組實驗小鼠右側耳廓,24h后處死動物,用打孔器取相同面積兩側耳片稱重,比較給藥組與對照組耳廓腫脹程度。
　　 4.正常小鼠50只,隨機分為5組,DMSO:橄欖油=1:9對照組、陽性藥物(靈芝多糖200mg/kg)組、靈芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)組,給藥組小鼠分別連續(xù)灌胃干預藥物7d。于第7天給藥后2h,先稱體重,然后每只小鼠尾靜脈注射生理鹽水稀釋成5倍的印度墨汁0

8、.1ml/10g(體重),分別于注射2min(t1)和12min(t2)后,用預先經(jīng)肝素溶液濕潤過吸頭的微量加樣器自眶后靜脈叢取血10μl,放入盛有1ml蒸餾水的離心管中,搖勻,然后取100μl放入96孔板中,用酶標儀在450nm波長處測光密度OD值。
　　 5.正常小鼠50只,隨機分為5組,DMSO:橄欖油=1:9對照組、陽性藥物(靈芝多糖200mg/kg)組、靈芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)組,給藥組小鼠分

9、別連續(xù)灌胃干預藥物7d。給藥后第2天上午,各鼠腹腔注射20％(V/V)的生理鹽水兔紅細胞0.2ml進行免疫,同日下午繼續(xù)給藥,免疫后d6(免疫當天為d0),動物摘眼球取血,分離和收集血清用于血清溶血素水平測定。
　　 6.皮下注射環(huán)磷酰胺復制免疫功能低下的動物模型。小鼠60只,隨機分為6組,正常對照組、環(huán)磷酰胺模型組、靈芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)+環(huán)磷酰胺組,陽性藥物(靈芝多糖200mg/kg)組,采用DN

10、FB誘導遲發(fā)型變態(tài)反應(delayed—type hypersensitivity,DTH)模型,觀察小鼠細胞免疫功能；碳廓清法檢測單核巨噬細胞的吞噬功能；兔紅細胞免疫法檢測體液免疫功能。
　　 7.建立荷S180實體瘤小鼠動物模型,DMSO:橄欖油=1:9對照組；陽性對照組靈芝多糖200mg/kg；靈芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)組,采用DNFB誘導DTH模型,觀察小鼠細胞免疫功能；碳廓清法檢測單核巨噬細胞的

11、吞噬功能；兔紅細胞免疫法檢測體液免疫功能。
　　 8.無菌取S180腹水瘤小鼠乳白色腹水,加入靈芝氯仿萃取部位,在37℃下培養(yǎng)48h,用MTT比色法檢測S180細胞代謝活力。
　　 9.建立荷S180實體瘤小鼠動物模型,DMSO:橄欖油=1:9對照組；陽性對照組:靈芝多糖200mg/kg;靈芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)組；連續(xù)給藥7d,分離瘤體,稱重,并計算抑瘤率。
　　 10.結果以均數(shù)±標

12、準差(mean±sd)表示,統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。多個樣本均數(shù)比較,經(jīng)方差齊性檢驗后進行單因素方差分析(One—WayANOVA),方差齊性時,行Fisher方差分析,采用LSD方法進行組間兩兩比較；方差不齊時,作Welch法方差分析,再用Dunnett T3方法進行組間兩兩比較。顯著性水準取α=0.05,以P<0.05時,組間差異判斷為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.靈芝氯仿萃取部位高、中、低

13、濃度(100,50,25μg/ml)均可顯著抑制ConA誘導的小鼠脾細胞增殖反應(代謝活力),與ConA組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.000,P=0.000,P=0.026)；靈芝氯仿萃取部位高、中.低濃度(100,50,25μg/ml)均可顯著抑制LPS誘導的小鼠脾細胞增殖反應,與LPS組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.000,P=0.002,P=0.028),且在一定范圍內呈濃度依賴趨勢。
　　 2.靈芝氯仿萃取部位高、中、低劑量(

14、200,100,50mg/kg)均無提高正常小鼠DTH反應所致的耳廓腫脹度和單核巨噬細胞吞噬功能；而高、中劑量(200,100mg/kg)均可顯著地升高正常小鼠血清溶血素水平(P=0.002,P=0.031)。
　　 3.靈芝氯仿萃取部位高、中劑量(200,100mg/kg)均可顯著提高環(huán)磷酰胺誘導免疫抑制小鼠DTH反應耳廓腫脹度(P=0.000,P=0.033),提高免疫抑制小鼠細胞免疫功能；靈芝氯仿萃取部位高、中劑量(200

15、,100mg/kg)可以顯著提高環(huán)磷酰胺誘導免疫抑制小鼠體內碳粒廓清能力(P=0.001,P=0.019),提高免疫抑制小鼠單核巨噬細胞吞噬功能；靈芝氯仿萃取部位高、中劑量(200,100mg/kg)均可顯著提高環(huán)磷酰胺誘導免疫抑制小鼠血清溶血素水平(P=0.000,P=0.001),提高免疫抑制小鼠體液免疫功能。
　　 4.靈芝氯仿萃取部位高、中劑量(200,100mg/kg)可以顯著增強荷瘤小鼠體內單核/巨噬細胞吞噬能力(P

16、=0.001,P=0.015),提高荷瘤小鼠單核巨噬細胞吞噬功能；靈芝氯仿萃取部位高、中劑量(200,100mg/kg)均可顯著提高荷瘤小鼠DTH反應所致的耳廓腫脹度(P=0.001,P=0.011),提高荷瘤小鼠細胞免疫功能；靈芝氯仿萃取部位高、中劑量(200,100mg/kg)均可顯著提高荷瘤小鼠血清溶血素水平(P=0.000,P=0.000),提高荷瘤小鼠體液免疫功能。
　　 5.靈芝氯仿萃取部位(100,50μl/ml)

17、高、中劑量顯著地抑制小鼠S180細胞的代謝活力(P=0.000,P=0.000,P=0.000)；靈芝氯仿萃取部位(200μg/ml)高劑量對小鼠S180實體瘤生長有顯著抑制作用(P=0.001)。
　　 結論
　　 1.靈芝氯仿萃取部位體外抑制小鼠T細胞和B細胞的增殖反應。
　　 2.靈芝醇體內氯仿萃取部位對正常小鼠的細胞免疫反應和單核/巨噬細胞的吞噬功能無明顯作用,而增強小鼠的體液免疫反應。
　　 3

18、.采用環(huán)磷酰胺成功建立免疫功能低下的小鼠實驗模型。
　　 4.靈芝氯仿萃取部位能顯著增加環(huán)磷酰胺誘導的免疫功能抑制小鼠的校正碳廓清指數(shù)A,提高吞噬活性,促進血清溶血素抗體生成,增強遲發(fā)型超敏反應,提示靈芝氯仿萃取部位能促進免疫功能低下小鼠非特異性和特異性(體液免疫和細胞免疫)免疫功能。
　　 5.靈芝氯仿萃取部位能顯著地增強荷瘤小鼠單核巨噬細胞功能,提高其校正碳廓清指數(shù)A,提高吞噬活性,促進血清溶血素抗體生成,增強遲發(fā)性