益腎緩衰方對腎小管間質纖維化的實驗研究.pdf

1、背景:腎小管間質纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis TIF)是各種腎臟疾病進展至終末期腎病的共同表現和主要病理基礎,是腎功能衰竭的共同途徑[1]。它是以腎小管上皮細胞變性、萎縮、消失,間質中淋巴細胞和單核細胞浸潤、同時聚集大量的肌成纖維細胞和細胞外基質為主要特征[2]。在二十世紀的漫長歲月罩人們對腎臟疾病的研究中,對腎小球疾病的認識相對較深入,而對腎小管間質病理改變的研究相對較少,甚至是忽略掉的。

2、自上世紀九十年代,Risdon等首次發(fā)現腎小球濾過率(GFR)的下降與腎小管萎縮呈正相關,而與腎小球損害無明顯相關性以來,越來越多的研究表明,腎功能損害與腎小管間質病理改變的程度密切相關[3]。在終末期腎病(ESRD)患者中腎小管間質疾病為原發(fā)病的占到20％-30％,而在各種常見的腎小球疾病發(fā)展的不同階段都合并有不同程度的腎小管間質的損傷。有大量臨床和試驗研究表明,腎小管間質損害程度與腎功能的相關性比腎小球病變更為密切,是反映腎功能下降

3、嚴重程度及判斷預后最重要的指標[4]。我們可以認為在CKD進展過程中,腎小管間質損傷起著比腎小球病變更為重要的作用,并決定著CKD的預后和轉歸[5]。因此,探討腎間質纖維化的形成機制及防治措施,在臨床上尋找能阻止或減緩腎間質纖維化的藥物具有重要意義。益腎緩衰方作為我院院內制劑用于慢性腎衰竭治療已近二十年,并取得了良好的臨床療效。主要藥物組成有生黃芪、人參、當歸、川芎、赤芍、茯苓、雞血藤、熟大黃等,是具益氣養(yǎng)血活血、利濕瀉濁之功的中藥復方

4、。我科已往的研究工作證實該藥能減輕5/6腎切除造模大鼠殘余腎ECM的積聚,抑制促纖維化因子TGF—β在殘余腎表達,改善腎小球硬化和抑制小管-間質纖維化程度[6]。在緩衰方對5/6腎切除大鼠腎內微血管重塑及血管內皮生長因子(VEGF)表達影響的研究中證實,緩衰方與血管緊張素轉換酶受體拮抗劑(科素亞)均有促進殘余腎內VEGF表達,減輕腎內微血管丟失以及減輕腎纖維化程度的作用。通過益腎緩衰方治療46例慢性馬兜鈴酸腎病臨床觀察研究我們發(fā)現,此方

5、可明顯延緩慢性馬兜鈴酸腎病患者腎功能進行性減退的速度。[7]而在通過對腎活檢的腎小管間質損傷較明顯的78名CKD患者的觀察,收集相關實驗室檢查指標,腎臟病理資料,結合中醫(yī)臨床資料進行分析,我們得出如下結論:(1)CKD患者血瘀證與腎小管間質損傷存在顯著相關性,血瘀證可能是CKD患者中醫(yī)證候因素中影響CKD進展的關鍵因素。(2)濕熱證與血瘀證之間存在密切聯系,“濕熱夾瘀”是CKD患者中醫(yī)證候的重要內容。(3)在CKD患者濕熱證、血瘀證可能

6、是影響CKD進展的重要因素。這一有關腎小管間質纖維化的證型研究,為本次實驗選用益氣養(yǎng)血活血,利濕瀉濁之功的益腎緩衰方提供了堅實依據,為進一步闡明中醫(yī)藥在腎小管間質損傷中的作用提供了重要的理論基礎。
　　 目的:本研究通過對服用本院制劑益腎緩衰方、厄貝沙坦及動物無菌飲用水的單側輸尿管結扎(UUO)大鼠模型各組的腎臟纖維化程度的研究,以明確本院制劑益腎緩衰方在延緩腎間質纖維化及保護腎功能中的作用。通過利用UUO大鼠小管間質損傷模型,

7、觀察藥物對大鼠血液生化指標的影響,組織病理損害的程度,采用免疫組化法檢測大鼠腎臟組織中α-平滑肌肌動蛋白(α—SMA),骨形態(tài)形成蛋白-7(BMP-7)的表達,探索這兩者的相關機制和聯系性,探討益腎緩衰方是否能通過調節(jié)α—SMA及BMP-7的表達,從而達到減輕腎臟病理變化,改善腎功能的作用。探討益氣活血利濕法在腎小管間質纖維化中的防治作用及中醫(yī)藥在腎小管間質纖維化中的積極作用,為臨床上CKD患者的治療提供可推廣的有效藥物與相應的診療思路

8、。
　　 方法:本實驗以180—200g健康雄性Wister大鼠(解放軍軍事醫(yī)學科學院提供)為研究對象,動物適應性飼養(yǎng)一周后,將32只大鼠隨機分為四組,每組8只:假手術組,模型組,中藥組,厄貝沙坦組。其中模型組,中藥組及厄貝沙坦組造UUO大鼠模型:均用10％水合氯醛(2.0～3.0ml/kg)腹腔注射麻醉,手術野去毛,75％乙醇消毒,選擇腹正中線切口稍偏左,依次切開皮膚至腹腔,游離腎臟及輸尿管,將左側輸尿管用組織鉗托起中段部位,

9、止血鉗夾住,在兩端用4—0絲線結扎左側輸尿管近腎盂段及遠端,然后連續(xù)縫合皮膚。[8]假手術組手術入路方式同模型組,但打開腹腔后游離輸尿管不結扎,即縫合皮膚。模型組予動物無菌飲用水12ml/kg.d,假手術組予動物無菌飲用水12ml/kg.d,中藥組:予中藥藥液12ml/kg.d(用藥量相當于成人每天每公斤體重的15倍)厄貝沙坦組予1mg/ml濃度厄貝沙坦溶液(無菌飲用水每日現配),12ml/kg.d,各組均連續(xù)灌胃10天,日一次。術后第

10、10d處死各組大鼠,從股動脈采血,分離血清,測定血肌酐(Scr),尿素氮(BUN)。剖取左側腎臟原位灌洗,用10％甲醛固定,石蠟包埋,以2um厚切片,行常規(guī)HE染色,以了解各組病理改變情況,行Masson染色,用顯微鏡圖像分析儀(Olympus ix70倒置熒光顯微鏡)及Imagepruplus圖像分析系統(tǒng)進行分析,陽性面積(μm2)作為統(tǒng)計數據,評定各組腎小管間質損害程度。最終結果采用SPSS統(tǒng)計軟件進行相關分析。
　　 結果

11、:
　　 (1)腎功能測定:與假手術組相比較,其余三組Scr均明顯升高(P<0.05),經中藥及厄貝沙坦治療后,下降不明顯(P>0.05)。而BUN檢測顯示,與假手術組比較,其余三組BUN均明顯上升(P<0.05),但與模型組比較,中藥組與厄貝沙坦組均有明顯下降(P<0.05),兩治療組之間比較,無明顯差別。(P>0.05)。即經過治療后,對Scr影響不明顯,對BUN有較明顯的影響,但未降至正常水平。
　　 (2)腎臟病

12、理:肉眼觀察可見:假手術組大鼠腎臟顏色暗紅,大小形態(tài)正常。模型組,中藥組及厄貝沙坦組大鼠結扎側腎臟顏色淡,腫大明顯,有囊性感,內存黃褐色混濁液體,腎盂明顯擴張,實質變薄。光鏡下可見:①HE染色,假手術組偶見。腎小管上皮細胞空泡變性,灶狀單核細胞浸潤；模型組可見彌漫的。腎小管上皮細胞空泡變性,部分管腔內有蛋白或細胞管型,灶狀小管擴張、萎縮,偶見壞死,腎間質有多灶狀單核細胞浸潤和纖維化,腎小球無明顯病理變化。中藥組及厄貝沙坦組上述改變均有所

13、減輕。②Masson染色,模型組可見間質大量藍染膠原纖維增生,腎小球病變不明顯。中藥組,厄貝沙坦組腎間質膠原纖維陽性染色面積較模型組均明顯下降(P<0.01),兩治療組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (3)腎臟中α-SMA、BMP-7的表達及變化:α-SMA在各組中的表達:假手術組的血管壁平滑肌細胞呈強陽性表達,腎小球和腎小管上皮細胞無明顯著色,腎髓質稀疏散在分布呈弱陽性。模型組表達部位以腎間質為主,主要圍繞在

14、萎縮或擴張的腎小管周圍,或纖維化的腎間質中。中藥組和厄貝沙坦組可見散在于纖維化的腎間質處有少量表達；BMP-7在各組中的表達:假手術組大鼠腎臟在遠曲小管、集合管均有表達,且表達較強烈,在近端小管上皮細胞有少量表達,在腎小球內基本無表達。在髓質區(qū)表達明顯高于在皮質區(qū)的表達。模型組大鼠腎間質纖維化程度加重,BMP-7表達明顯減少；中藥組和厄貝沙坦組大鼠。腎臟BMP-7表達量均較模型組明顯增加,較假手術組減少。
　　 結論:
　

15、　 1.益腎緩衰方可明顯降低血清尿素氮含量,效果與厄貝沙坦無明顯差別。但無明顯降低肌酐作用,厄貝沙坦亦相同。
　　 2.益腎緩衰方與厄貝沙坦均可抑制α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達,增加骨形態(tài)形成蛋白-7(BMP-7)在UUO大鼠腎臟組織中的表達,抑制了腎小管上皮細胞轉分化,增加了ECM的降解,且兩治療組間差異無統(tǒng)計學意義,說明益腎緩衰方治療效果與厄貝沙坦相似,均有減輕腎臟纖維化作用。
　　 3.益腎緩衰方組與模

16、型組比較,α—SMA的陽性表達面積、Masson染色的膠原纖維面積均減少,證實益腎緩衰方減少了增生的ECM成分,減輕腎臟纖維化的病變程度。
　　 4.在腎小管間質纖維化過程中,腎間質纖維化面積與BUN、Scr均呈正相關(r=0.637,P<0.001),提示腎功能損害與間質纖維化程度相關,與α-SMA的表達呈正相關(r=0.845,P<0.001),與BMP-7的表達呈負相關(r=-0.865,P<0.001),α-SMA與BM