丙烯酰胺誘導(dǎo)HT22小鼠海馬神經(jīng)元損傷作用的研究.pdf

1、丙烯酰胺（Acrylamide，ACR）是一種高水溶性的α,β-不飽和羰基化合物，主要用來合成聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺在采礦業(yè)、污水凈化、造紙業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。聚丙烯酰胺無毒，但丙烯酰胺單體是有毒的。自2002年科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)富含淀粉的食物在經(jīng)受高溫油炸或烘烤時(shí)能生成丙烯酰胺后，其危害日益引起人們的重視。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、致癌性、遺傳毒性、生殖毒性，但在人群中卻只發(fā)現(xiàn)了它的神經(jīng)毒性。丙烯酰胺神經(jīng)毒性的臨床表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、骨

2、骼肌無力，體重減輕；病理表現(xiàn)為中樞和周圍神經(jīng)軸突的遠(yuǎn)端腫脹和終末變性，并逐漸向近端擴(kuò)展。
　　丙烯酰胺引起神經(jīng)毒性的可能機(jī)制主要有抑制快速軸突運(yùn)輸、改變神經(jīng)遞質(zhì)水平和功能、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、影響細(xì)胞骨架系統(tǒng)、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能量代謝等。此外，氧化應(yīng)激和促進(jìn)細(xì)胞凋亡也可能是丙烯酰胺潛在的神經(jīng)毒性機(jī)制。我們實(shí)驗(yàn)室前期工作已證實(shí)：丙烯酰胺亞急性染毒能夠引起幼年大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷，大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元和小腦皮質(zhì)內(nèi)浦肯野細(xì)胞發(fā)生變性損傷；

3、胚胎期和哺乳期暴露于丙烯酰胺能導(dǎo)致幼鼠出生時(shí)體重降低，哺乳期間體重增長(zhǎng)緩慢，并影響到海馬神經(jīng)元的發(fā)育。海馬主要參與學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)等多種功能活動(dòng)，其損傷能對(duì)學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生影響，有研究證實(shí)丙烯酰胺能夠損傷海馬，但損傷的具體機(jī)制目前尚不明確。
　　為此，我們開展了丙烯酰胺的體外毒性研究。HT22細(xì)胞是一種永生化的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，具有典型的神經(jīng)元形態(tài)及特征，其表型與神經(jīng)元前體細(xì)胞最為相似，被廣泛應(yīng)用于研究藥物的神經(jīng)毒性、神經(jīng)元的損

4、傷和保護(hù)之中。但用HT22細(xì)胞來建立丙烯酰胺體外損傷模型的相關(guān)研究少見報(bào)道，故本研究以HT22細(xì)胞為細(xì)胞模型，研究丙烯酰胺對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷作用，并對(duì)其損傷的可能機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法：
　　1.丙烯酰胺對(duì)HT22細(xì)胞存活率的影響及模型濃度的篩選：當(dāng)HT22細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，加入不同濃度的丙烯酰胺，處理24h、36h和48h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀態(tài)，并選擇合適的濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　2.丙烯酰胺對(duì)HT22細(xì)

5、胞損傷的影響研究：當(dāng)HT22細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，加入不同濃度的丙烯酰胺處理24h后，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化；Hoechst33258染色來觀察各組細(xì)胞核的變化；應(yīng)用試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）的漏出量。
　　3.丙烯酰胺對(duì)HT22細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響研究：用DCFH-DA熒光探針來檢測(cè)活性氧ROS的含量；黃嘌呤氧化法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）的活力；硫代巴比妥酸（TBA）法檢測(cè)丙二醛（MDA）的含量；二硫代二硝基苯甲

6、酸（DTNB）法檢測(cè)還原型谷胱甘肽（GSH）的含量。
　　4.丙烯酰胺對(duì)HT22細(xì)胞凋亡的影響研究：羅丹明123（Rh123）染色檢測(cè)線粒體膜電位（MMP）的變化；Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的丙烯酰胺（0、1、2、3、4、8、16mmol/ L）處理HT22細(xì)胞24h、36h和48h后，細(xì)胞存活率隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)

7、而降低，說明丙烯酰胺對(duì)HT22細(xì)胞存活率的影響呈時(shí)間和劑量依賴性。
　　2.我們選用0、1、2、3mmol/ L的丙烯酰胺濃度處理HT22細(xì)胞24h來作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的損傷濃度。倒置顯微鏡下觀察到隨著濃度的升高，細(xì)胞胞體逐漸變圓，突起變短，折光率下降；用Hoechst33258染料染色，對(duì)照組細(xì)胞核均勻淡染，邊緣清晰；而染毒組的細(xì)胞核有深染固縮、形狀不規(guī)則、裂解的核出現(xiàn)，與對(duì)照組相比異常核的數(shù)量也有增加；且隨著ACR濃度的增加，培養(yǎng)上

8、清中LDH的含量也顯著增加（P<0.05 vs對(duì)照組）。
　　3.丙烯酰胺處理HT22細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)ROS的積聚增加，MDA的含量升高，SOD的活性下降，GSH的含量下降。
　　4.丙烯酰胺處理HT22細(xì)胞24h后，細(xì)胞線粒體膜電位下降；Bax和Cleaved caspase3蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.丙烯酰胺可以抑制HT22細(xì)胞的增殖，且對(duì)其影響呈時(shí)間和劑量依