甘藍(lán)型油菜組織特異性啟動(dòng)子的分離與鑒定.pdf

1、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)作為我國(guó)最重要的油料作物之一，已成為國(guó)產(chǎn)食用植物油的第一大來(lái)源，2009年菜籽油已占國(guó)產(chǎn)油料作物產(chǎn)油的57％以上，但國(guó)內(nèi)食用植物油自給率不到40％，且南方冬閑田油菜產(chǎn)量和含油量較低、抗性較弱且不適宜機(jī)械化操作，而通過(guò)基因工程技術(shù)分離出具有較高應(yīng)用價(jià)值的啟動(dòng)子來(lái)提高油菜抗性和光合效率等性狀，逐步擴(kuò)大和提高其種植面積與產(chǎn)量，為有效解決我國(guó)植物油問(wèn)題具有重要意義。組織特異啟動(dòng)子能專門調(diào)控基因在特定的組

2、織部位或器官中表達(dá)，不僅可以克服組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因的非特異持續(xù)表達(dá)所造成浪費(fèi)以及特定部位表達(dá)量上的不足，還有效避免轉(zhuǎn)基因作物種植中發(fā)生的基因逃逸現(xiàn)象，有效的解決了轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全問(wèn)題。因此，從甘藍(lán)型油菜中分離和鑒定油菜自身的組織特異性啟動(dòng)子，并研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，為油菜及其近緣物種的基因功能研究和基因工程改良奠定基礎(chǔ)。
　　本研究首先根據(jù)擬南芥基因芯片和白菜與甘藍(lán)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選在根、莖、葉、花組織中特異表達(dá)候選基因，并

3、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)候選基因進(jìn)行組織特異性檢測(cè)和表達(dá)模式分析;其次，利用5'RACE技術(shù)獲得其準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，通過(guò)同源克隆方法獲得RO-4、LE-7、FL-1、FL-4和ST-7啟動(dòng)子序列，并利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其順式調(diào)節(jié)元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。最后，利用雙酶切技術(shù)構(gòu)建其相應(yīng)的植物表達(dá)載體并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化中油821下胚軸，通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株驗(yàn)證分析啟動(dòng)子表達(dá)的特異性和表達(dá)強(qiáng)度。同時(shí)為了進(jìn)一步研究特異啟動(dòng)子中的核

4、心序列位置與功能，分別設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段，采用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建啟動(dòng)子的缺失表達(dá)載體，通過(guò)花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，驗(yàn)證啟動(dòng)子中核心序列的位置及功能。具體結(jié)論如下:
　　1.采用生物信息學(xué)分析方法從擬南芥基因芯片及白菜與甘藍(lán)表達(dá)譜數(shù)據(jù)中篩選鑒定出24個(gè)組織特異表達(dá)的候選基因，從24個(gè)候選基因中獲得了14個(gè)組織特異表達(dá)基因，qPCR分析結(jié)果表明RO-4在根部特異表達(dá)、LE-7在葉片特異表達(dá)、ST-7在根莖角果皮中特異表達(dá)、

5、FL-1和FL-4在花器官特異表達(dá)。通過(guò)對(duì)qPCR檢測(cè)片段、5'RACE末端及基因5'末端序列測(cè)序結(jié)果分析證實(shí)擴(kuò)增片段是來(lái)自qPCR檢測(cè)為組織特異表達(dá)的候選基因基因，啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為1305-1566bp（包含5'-UTR序列），轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于翻譯起始位點(diǎn)上游53-269bp，并包含核心啟動(dòng)元件TATA-box及多個(gè)增強(qiáng)子元件CAAT-box，另外光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)元件也廣泛存在于啟動(dòng)子中。
　　2.克隆獲得5個(gè)組織特

6、異啟動(dòng)子片段，分別是RO-4(1475bp)、LE-7(1566bp)、FL-1(1372bp)、FL-4(1517bp)和ST-7(1305bp)，利用BamHI和NcoⅠ雙酶切將RO-4、LE-7、FL-1和FL-4分別亞克隆到相同酶切位點(diǎn)的粘性末端載體骨架pCAMBIA1305.1上，最終成功構(gòu)建promoter-GUS載體p1305.1-RO-4P、p1305.1-LE-7P、p1305.1-L-1P和p1305.1-FL-4P

7、;同樣利用SacⅠ/NcoⅠ雙酶切將ST-7替換pCAMBIA1305.1上的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建植物表達(dá)載體p1305.1-ST-7P。然后將構(gòu)建的植物表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株GV3101中獲得工程菌株。
　　3.將構(gòu)建的植物表達(dá)載體p1305.1-RO-4P和p1305.1-LE-7P通過(guò)下胚軸浸染法遺傳轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜DH系中油821，經(jīng)多重PCR鑒定，成功獲得p1305.1-RO-4P和p1305.1-LE-7P轉(zhuǎn)

8、基因陽(yáng)性植株，GUS組織化學(xué)染色證實(shí)LE-7啟動(dòng)子主要在葉片中表達(dá)，在花和花蕾、根、角果皮中基本上不表達(dá);RO-4啟動(dòng)子在葉片邊緣表達(dá)，其他部位因生長(zhǎng)情況還未檢測(cè)。
　　4.克隆獲得6個(gè)RO-4缺失啟動(dòng)子，分別是R1(1301bp)、R2(1030bp)、R3(622bp)、R4(481bp)、R5(352bp)和R6(252bp);5個(gè)E-7P缺失啟動(dòng)子即L1、L2、L3、L4和L5，長(zhǎng)度分別為925bp、755bp、526bp