反式桂皮醛對(duì)髓細(xì)胞白血病細(xì)胞體外效應(yīng)的研究.pdf

1、第一部分、反式桂皮醛對(duì)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 目的：研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對(duì)急性髓細(xì)胞白血?。╝cutemyeloid leukemia，AML）細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法：用不同濃度的TCA和/或阿糖胞苷（β-D-Arabinofuranosyl cytosine，AraC）處理AML細(xì)胞株HL60 或AML初治患者及健康人骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marr

2、owmononuclear cell，BMMNC）。CCK-8法測(cè)定HL60細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HL60細(xì)胞周期變化，Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測(cè)HL60細(xì)胞和BMMNC凋亡，CD45/CD34/Annexin V三標(biāo)法檢測(cè)BMMNC CD34+細(xì)胞凋亡。Western blot檢測(cè)TCA處理后HL60細(xì)胞c-myc基因表達(dá)。激光共聚焦術(shù)檢測(cè)TCA處理后HL60細(xì)胞NF-κB活性。甲基纖維素法檢測(cè)TCA處理后BMMNC克隆

3、形成。 結(jié)論：TCA通過使NF-κB失活，下調(diào)原癌基因c-myc的表達(dá)，使HL60細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗白血病效應(yīng)。TCA對(duì)AML BMMNC和CD34+細(xì)胞也產(chǎn)生明顯的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，并能協(xié)同AraC發(fā)揮抗白血病效應(yīng)，對(duì)正常BMMNC的細(xì)胞毒作用很小。 第二部分、反式桂皮醛對(duì)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 目的：研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對(duì)慢性髓細(xì)胞白血

4、?。╟hronicmyeloid leukemia，CML）細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法：用不同濃度的TCA處理CML細(xì)胞株K562和初治CML患者及健康人骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cell，BMMNC）。CCK-8法測(cè)定K562細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞周期變化、K562細(xì)胞和BMMNC凋亡及K562細(xì)胞膜電位和Fas抗原表達(dá)。Western blot檢測(cè)K562細(xì)胞c-my

5、c基因表達(dá)和Crkl蛋白磷酸化水平。Real time PCR檢測(cè)K562細(xì)胞Bcr-Abl mRNA表達(dá)。甲基纖維素法檢測(cè)CMLBMMNC克隆形成。 結(jié)論：低濃度TCA（≤30 μM）早期可能促進(jìn)K562細(xì)胞增殖，而后期可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)。中濃度TCA（60 μM）早期阻滯細(xì)胞周期于G2 /M期，而隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。高濃度TCA（≥90 μM）則通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制K562細(xì)胞的

6、生長(zhǎng)，凋亡率呈時(shí)間和劑量依賴性。兩條主要的凋亡通路，即線粒體介導(dǎo)和Fas介導(dǎo)的凋亡通路，都參與了TCA誘導(dǎo)的凋亡。TCA可能通過抑制Bcr-Abl轉(zhuǎn)錄，從而減少Bcr-Abl蛋白產(chǎn)物，削弱酪氨酸激酶效應(yīng)，下調(diào)c-myc癌基因的蛋白表達(dá)，導(dǎo)致CML細(xì)胞凋亡、抑制CML細(xì)胞增殖。以上提示TCA具有明顯的抗慢性髓細(xì)胞白血病效應(yīng)，對(duì)正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞毒作用很小，是一個(gè)很有應(yīng)用前景的藥。 第三部分、反式桂皮醛誘導(dǎo)髓細(xì)胞白血病細(xì)胞分化

7、。 目的：本部分旨在研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對(duì)髓細(xì)胞白血病細(xì)胞分化的影響及機(jī)制。 方法：用TCA和/或反式維甲酸（all-trans-Retinoic acid，ATRA）處理髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞及K562細(xì)胞。相差顯微鏡和Wright’s-Gimsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分化抗原表達(dá)、細(xì)胞周期和凋亡。Western blot檢測(cè)HL60細(xì)胞c-myc

8、基因和p27基因表達(dá)、K562細(xì)胞c-myc基因表達(dá)和Crkl蛋白磷酸化水平。激光共聚焦術(shù)檢測(cè)HL60細(xì)胞p16基因和Cdc6基因表達(dá)變化。 結(jié)論：TCA（≤60 μM）可誘導(dǎo)髓細(xì)胞白血病細(xì)胞分化，但不同種類的細(xì)胞對(duì)TCA的反應(yīng)有差異性，而且同種白血病細(xì)胞對(duì)不同濃度的TCA的反應(yīng)不同。TCA 誘導(dǎo)HL60白血病細(xì)胞分化與c-myc蛋白水平下降和p27蛋白水平上調(diào)有關(guān)，p16基因和Cdc6基因參與TCA誘導(dǎo)的HL60細(xì)胞分化過程。

9、TCA可增強(qiáng)ATRA對(duì)HL60細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效應(yīng)。TCA誘導(dǎo)K562細(xì)胞的分化與c-myc和Crkl蛋白磷酸化水平下降有關(guān)。 第四部分、反式桂皮醛對(duì)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞粘附和遷移的影響。 目的：本部分旨在研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對(duì)急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）細(xì)胞粘附和遷移的影響。 方法：TCA處理AML細(xì)胞株HL60細(xì)胞，流式檢

10、測(cè)細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)。Transwell法檢測(cè)不同濃度TCA對(duì)重組基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）誘導(dǎo)的HL60遷移和浸潤(rùn)的影響。羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE）標(biāo)記HL60細(xì)胞，共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HL60細(xì)胞染色情況。CFSE標(biāo)記的HL60細(xì)胞與AML骨髓基質(zhì)細(xì)胞（b

11、one marrow stromal cell，BMSC）共培養(yǎng)，用共聚焦檢測(cè)不同濃度TCA處理后HL60細(xì)胞與AML BMSC的粘附情況。ELISA法檢測(cè)TCA對(duì)AML BMSC分泌SDF-1α的影響。相差顯微鏡觀察TCA處理后AML BMSC細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AMLBMSC細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：TCA除可直接抑制白血病細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和分化外，還可能通過下調(diào)白血病細(xì)胞CXCR4表達(dá)、抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞SDF

12、-1分泌和誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡、抑制白血病細(xì)胞對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的趨化，使白血病細(xì)胞一方面失去基質(zhì)層的支持，另一方面易于發(fā)生凋亡，因此有可能削弱骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞潛在的保護(hù)作用，有利于清除髓內(nèi)白血病細(xì)胞。 第五部分、反式桂皮醛調(diào)節(jié)髓細(xì)胞白血病細(xì)胞mel18基因表達(dá)。 目的：本研究旨在檢測(cè)mel18基因在急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的表達(dá)，研究mel18基因?qū)ML細(xì)胞的增殖、

13、凋亡和周期的影響，探討反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對(duì)AML細(xì)胞mel18基因的調(diào)控。 方法：運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)白血病細(xì)胞株mel18 mRNA表達(dá)，生物素-生物素-過氧化物酶（avidin-biotin-peroxidase complex，ABC）法免疫組織化學(xué)（immun

14、ohistochemistrystain，IHC）染色分析髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株、初治AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞和健康人外周血及骨髓單個(gè)核細(xì)胞的Mel18蛋白表達(dá)。運(yùn)用十四酰佛波乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetaet，PMA）誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化，流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化法和激光共聚焦術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)分化細(xì)胞的Mel18蛋白表達(dá)變化。通過基因重組和分子克隆技術(shù)構(gòu)建pLenti6/V5-mel18真核表達(dá)載體并鑒定，應(yīng)用脂

15、質(zhì)體（Lipofectamine2000）轉(zhuǎn)染，將pLenti6/V5-mel18和pLenti6/V5-LacZ（陰性對(duì)照）導(dǎo)入HL60和U937細(xì)胞。RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)pLenti6/V5-mel18質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中mel8基因的表達(dá)。用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。TCA誘導(dǎo)K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞分化，流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦術(shù)檢測(cè)Mel18蛋白表達(dá)。 結(jié)論：mel18基因在AM