缺血再灌注中酸敏感離子通道引起神經(jīng)元損傷機(jī)制及葛根素保護(hù)作用的研究.pdf

1、缺血性腦卒中是一類具有高死亡率和高致殘率的腦血管疾病，其主要病理變化是缺血性神經(jīng)元損傷。許多繼發(fā)因素在缺血后的腦損傷中發(fā)揮重要作用。酸中毒(acidosis)是腦缺血再灌注過程中的常見現(xiàn)象。腦缺血時(shí)，由于乳酸堆積和ATP水解產(chǎn)生H+，導(dǎo)致組織酸化，這種情況可以一直延續(xù)至再灌注4小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間，高血糖狀態(tài)下細(xì)胞外pH可以降低至6.0。胞外酸化直接激活了酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)。酸

2、敏感離子通道是一類可以被胞外H+激活的陽(yáng)離子通道，目前為止共發(fā)現(xiàn)了6種ASICs蛋白亞型，分別分別由4種基因編碼。組織酸化誘發(fā)ASICs開放，乳酸堆積以及炎癥因子的釋放導(dǎo)致ASICs電流增大，大量Na+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞水腫。已有文獻(xiàn)報(bào)道，同聚體酸敏感離子通道la亞型(ASICla)通道對(duì)Ca2+有較大的通透性，加重胞內(nèi)Ca2+超載，引起神經(jīng)元死亡，缺血壞死區(qū)增大。盡管已知ASICs，尤其ASICla是腦缺血中非谷氨酸依賴性Ca2+毒性和腦

3、損傷的主要參與者，目前對(duì)于ASICs在腦缺血損傷作用機(jī)制并不明確，尋找可用于臨床的抑制ASICs的有效藥物也是難點(diǎn)之一。
　　 本論文建立了大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞酸中毒模型，在該模型上引入缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivaTiO2, OGD)和再灌注(reperfusion)的方法，綜合應(yīng)用膜片鉗技術(shù)、激光共聚焦顯微成像技術(shù)結(jié)合凋亡/壞死特異性檢測(cè)手段，研究ASICs以及ASICla在酸中毒引起細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制

4、，酸中毒在OGD及再灌注過程中的損傷作用及ASICs在其中的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究酸中毒在腦缺血性中風(fēng)中的作用奠定基礎(chǔ)。同時(shí)以常用的中風(fēng)治療藥物葛根素為對(duì)象，研究中藥在酸中毒損傷中的保護(hù)作用及對(duì)ASICs的調(diào)控機(jī)制。為開發(fā)新型的中風(fēng)治療藥物提供新的思路和靶點(diǎn)。
　　 本論文的主要研究結(jié)果有：
　　 1.建立穩(wěn)定的酸中毒損傷模型，并判斷酸敏感離子通道(ASICs)是否參與酸中毒引起的神經(jīng)元損傷。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以pH6.0的胞外液

5、造模4小時(shí)后，ASICs的阻斷劑amiloride以及ASICla的特異性阻斷劑PcTxl均能抑制酸中毒引起的神經(jīng)元損傷，改善神經(jīng)元活性。
　　 2.建立穩(wěn)定簡(jiǎn)易的快速給藥、灌流系統(tǒng)，結(jié)合膜片鉗離子通道電流檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)胞外pH下降對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元電活動(dòng)的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胞外pH下降能引起一個(gè)幅值較大的慢激活、慢失活的內(nèi)向電流。ASICs抑制劑amiloride能濃度依賴性地抑制該電流，其最大半數(shù)激活電流濃度分別為13.8μM，因

6、此判斷胞外pH快速下降激活的通道是ASICs。
　　 3.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胞外酸環(huán)境能抑制培養(yǎng)了12天以后的神經(jīng)元產(chǎn)生的自發(fā)電流，而這種自發(fā)電流是非ASICs依賴性的。
　　 4.葛根素對(duì)酸中毒損傷中的海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用。葛根素與PcTxl聯(lián)用并不能進(jìn)一步改善神經(jīng)元的活性，降低神經(jīng)元的死亡率。而電生理實(shí)驗(yàn)也證明葛根素對(duì)ASICs以及ASICla均具有濃度依賴性的抑制作用，由此推測(cè)葛根素通過抑制ASICs尤其是ASICla通道

7、的開放保護(hù)酸中毒損傷中的神經(jīng)元。
　　 5.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OGD和再灌注過程中，酸中毒均引起了神經(jīng)元的損傷，然而與OGD相比，再灌注過程中酸中毒損傷顯著加劇。在OGD過程中使用amiloride和PcTxl均沒有保護(hù)作用，但在再灌注過程中，amiloride和PcTxl均能改善酸中毒引起的細(xì)胞損傷，由此推測(cè)腦缺血/再灌注中，ASICs，尤其是ASICla的開放對(duì)神經(jīng)元的損傷作用主要發(fā)生在再灌注時(shí)期，而非缺血時(shí)期。此外，電生理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

8、，OGD時(shí)，胞外pH快速下降并不改變海馬神經(jīng)元上ASICs通道的幅值、失活時(shí)間常數(shù)，但是ASICs從脫敏狀態(tài)恢復(fù)至關(guān)閉狀態(tài)的時(shí)間大大延長(zhǎng)，其恢復(fù)時(shí)間常數(shù)從16.12±2.18s延長(zhǎng)至69.54±21.10s，由此引起ASICs開放頻率的大大下降，這可能是ASICs在OGD時(shí)并不起主要作用的原因。
　　 綜上所述，本研究的發(fā)現(xiàn)是：1）ASICs參與了酸中毒引起的神經(jīng)元損傷，但是ASICs沒有參與酸中毒引起的神經(jīng)元自發(fā)電流的降低；2

9、）葛根素對(duì)酸中毒引起的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制是濃度依賴性的抑制ASICs，尤其是ASICla通道電流；3）缺血再灌注過程中，酸中毒在缺血過程中引起神經(jīng)元的損傷，再灌注顯著加劇了神經(jīng)元損傷；4）ASICs主要在再灌注時(shí)期參與了神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因是OGD非常顯著地延長(zhǎng)了ASICs從脫敏狀態(tài)恢復(fù)的時(shí)間，由此導(dǎo)致ASICs開放頻率的下降。這些結(jié)果提示ASICs在腦缺血/再灌注過程中可能起了重要作用，以及葛根素在這一過程中