兒童結(jié)核性腦膜炎腦脊液蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究.pdf

1、目的：結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TM)是小兒時(shí)期一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病。其病死率為20﹪～50﹪，幸存者中有20﹪～30﹪留有永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。TM發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，診斷困難，預(yù)斤較差。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種研究特定細(xì)胞、組織或完整生物體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其活動(dòng)規(guī)律的新興學(xué)科。本實(shí)驗(yàn)通過該技術(shù)建立正常中國(guó)兒童及TM患兒腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)

2、蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜，篩選TM特異性蛋白，為TM的早期診斷提供線索，同時(shí)也為其發(fā)病機(jī)制的深入了解提供新思路。 方法：收集TM急性期、TM治療1個(gè)月后及正常對(duì)照組兒童CSF各5ml，三氯乙酸(trichloracetic acid，TCA)沉淀法獲取CSF總蛋白質(zhì)，固相PH梯度(immobile PH gradient，IPG)二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel elec

3、trophoresis，2D-PAGE)技術(shù)分離蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)染色，Imagescanner掃描儀以及LabScan掃描軟件對(duì)凝膠進(jìn)行掃描獲取圖像。利用圖像分析軟件PDQuest 7.0，以正常兒童CSF的2-DE凝膠為參考膠，將TM急性期CSF的凝膠與之進(jìn)行比較分析，尋找兩組CSF蛋白質(zhì)譜的異常變化斑點(diǎn)。再以TM急性期CSF凝膠為參考膠，將TM治療1個(gè)月后CSF凝膠與之比較分析，觀察差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的變化情況。篩選出分辨清楚、僅在T

4、M急性期CSF中表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，切取后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization timeof flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting，PMF)，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)獲取蛋白的基本信息，確定差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果：正常兒童CSF分離獲

5、得蛋白質(zhì)斑點(diǎn)533個(gè)，TM急性期CSF分離獲得蛋白質(zhì)斑點(diǎn)546個(gè)，其中有14個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅在正常CSF表達(dá)，27個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅在TM急性期CSF中表達(dá)，在TM急性期高豐度表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，在TM治療1個(gè)月后CSF中表達(dá)量均下調(diào)。與正常CSF蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量比較，TM急性期有15個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量有2倍以上的上調(diào)，而8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量有2倍以上的下調(diào)。共選出20個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，獲得了20張PMF。進(jìn)入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索后

6、匹配到蛋白質(zhì)的點(diǎn)有16個(gè)，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A-I、免疫球蛋白J鏈、人多克隆免疫球蛋白M冷凝集素Fab片段、免疫球蛋白λ輕鏈VLJ區(qū)、MGC3 1936蛋白、免疫球蛋白九輕鏈可變區(qū)、抗腫瘤壞死因子α抗體、免疫球蛋白G1 A鏈Fab片段、免疫球蛋白KC、HLA-Ⅱ類抗原DRB1-4、PRO2675蛋白、MRP14蛋白在TM。急性期CSF中特異性表達(dá)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次成功建立了正常兒童CSF與TM患兒CSF的雙向凝膠電泳圖譜。通過凝膠圖