一個新的白癜風相關(guān)黑素細胞膜抗原的確認.pdf

1、背景及目的:白癜風是一種常見多發(fā)的色素脫失性皮膚病，其發(fā)病機制存在多種學說，目前公認與自身免疫有重要關(guān)系。組織學及免疫細胞化學示白癜風表皮黑素細胞消失，活動性白斑邊緣的真皮內(nèi)有淋巴細胞浸潤；患者血清中存在抗黑素細胞抗體，且滴度與病變的程度成正比。多數(shù)學者認為，自身抗體與黑素細胞膜抗原結(jié)合后，通過補體溶解作用、ADCC作用兩條途徑實現(xiàn)對黑素細胞的破壞。就目前膜抗原研究的現(xiàn)狀來看，未知抗原較多，雖然已發(fā)現(xiàn)一個新的白癜風相關(guān)黑素細胞膜抗原MC

2、HR1，但白癜風患者中抗MCHR1自身抗體的陽性率僅為17.1％，抗MC膜表面抗原的自身抗體陽性率遠遠高于抗MCHR1的自身抗體，提示白癜風患者血清自身抗體所針對的MC膜表面抗原除了MCHR1外，應該另有成分。 本課題組從細胞直接接觸的膜蛋白入手，尋找具有高識別率的新的細胞膜抗原，為深入探討其功能及其在白癜風發(fā)病中的作用奠定基礎。課題組先期通過雙向電泳與免疫印跡組合策略發(fā)現(xiàn)了一個黑素細胞膜蛋白，根據(jù)其分子量稱為VIT75。白癜風

3、血清識別此蛋白的陽性率達70％；肽指紋圖(PMF)和肽序列BLAST檢索結(jié)果提示：所發(fā)現(xiàn)抗原為LAMINA/C的可能性最大，但通過原核表達LAMINA/C，以白癜風血清行免疫印跡，識別率不高，即不支持“冠軍肽”為LAMINA/C。 本研究擬在前期工作基礎上，以具有LAMINA/C的人成纖維細胞和黑素瘤細胞為研究對象，進行雙向電泳及免疫印跡，期望明確成纖維細胞膜上和黑素瘤細胞膜上，是否存在與黑素細胞膜上相同的免疫染色差異蛋白點，以

4、明確LAMINA/C與新抗原的相關(guān)性，為后續(xù)的蛋白功能和病理生理意義研究奠定扎實的基礎。 實驗方法: 第一部分細胞培養(yǎng)和鑒定 1.HEMn培養(yǎng)及純化：首先用含CT和bFGF的10％的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)表皮細胞4h，然后改用無血清的K-SFM液培養(yǎng)3d，以抑制成纖維細胞生長，最后傳代細胞采用含TPA和CT的5％的K-SFM液培養(yǎng)。 2.HEMn鑒定：Dopa染色鑒定及分析黑素細胞的性質(zhì)及純度。

5、 3.成纖維細胞純培養(yǎng)：真皮部分1:1比例加入0.05％Ⅰ型膠原酶后4℃消化過夜，過濾，1000rpm離心7分鐘后用無血清DMEM培養(yǎng)液懸浮3次，最后用15％的DMEM/F12調(diào)定細胞密度以每毫升(2-4)×105個細胞接種，37℃，5％CO2，90％濕度條件下培養(yǎng)，12小時后換液一次。 4.成纖維細胞鑒定：胰蛋白酶消化制得細胞懸液，培養(yǎng)5周的細胞以1萬/cm2密度接種于蓋玻片上，進行免疫組織化學染色，第1抗分別為波形蛋白(V

6、imentin)、結(jié)蛋白(Desmin)和第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FactorⅧ)單克隆抗體。 5.人黑色素瘤系Libr細胞培養(yǎng)：用含10％小牛血清的DMEM/F12按常規(guī)方法培養(yǎng)。 第二部分利用雙向電泳技術(shù)分離、分析黑素瘤細胞和成纖維細胞膜抗原 1.高滴度白癜風患者血清篩選：消化純的HEMn，以其作為抗原，活細胞ELISA法對180名白癜風患者的血清進行篩選。 2.膜蛋白的制備：在以往工作基礎上做了一定的改進

7、，引入CHAPS、硫脲、DTT等溶膜蛋白的特點裂解、抽提黑素瘤細胞及成纖維細胞膜蛋白。 3.雙向電泳分離及免疫印跡：首先，Bradford法定量上樣總蛋白，制備兩塊平行級2-DE，IPG干膠條(pH4-7)第一向等電聚焦(IEF)，而后行二向分離(SDS-PAGE)，銀染，掃描圖像后行免疫印跡，對比分析白癜風和健康人血清的免疫染色差異點。 結(jié)果:黑素瘤細胞膜上發(fā)現(xiàn)了與VIT75具有相同等電點和分子量的陽性點，提示黑素瘤細

8、胞膜上存在與正常黑素細胞膜的共同抗原，VIT75可能是介導殺傷黑素瘤細胞和破壞正常黑素細胞的特異性免疫反應的重要抗原。而成纖維細胞的免疫印跡圖中未發(fā)現(xiàn)有陽性著色點，因此否定了膜抗原VIT75是LAMINA/C的可能。因此，VIT75是一個新發(fā)現(xiàn)的白癜風抗原。下一步的研究目標是進一步明確VIT75基因序列，明確蛋白屬性，為蛋白的病理生理意義研究奠定基礎。 結(jié)論:VIT75是黑素瘤和黑素細胞膜上共有的尚未被認識的白癜風相關(guān)抗原，而非