枸杞多糖抗實驗性肝癌作用的病理定量分析及免疫學機制研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴重危害著人類的身心健康，原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，由于肝臟本身的解剖學和組織學特征，造成原發(fā)性肝癌極具侵襲性和轉(zhuǎn)移性，多數(shù)肝癌患者就診時已處于晚期，預(yù)后極差。盡管肝癌的診斷和治療水平在不斷提高，但肝癌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下，由于原發(fā)性肝癌外科手術(shù)切除率僅為10％左右，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，各種非手術(shù)療法仍然是原發(fā)性肝癌的主要治療方法，而傳統(tǒng)化療和放療均具有較嚴重的抑制免疫和造血功能的毒副作用。目前，肝癌治療措施強調(diào)通過西

2、醫(yī)、中醫(yī)及其他有效的手段和方法相結(jié)合的綜合治療，中醫(yī)藥在預(yù)防肝癌發(fā)生，減少復(fù)發(fā)，減輕放、化療的毒副作用，提高生存質(zhì)量，延長生存期等方面有獨特的優(yōu)勢，隨著醫(yī)藥科技的發(fā)展，中醫(yī)藥治療肝癌的臨床療效在不斷提高，藥物作用機制的研究也從多方面展開。 文獻報道，機體免疫功能低下以及腫瘤自身存在的多種免疫逃逸機制是引起惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素，如何改善腫瘤機體免疫功能狀態(tài)和干預(yù)免疫逃逸是目前腫瘤治療主要要解決的問題。 資料研究證實

3、，荷瘤機體內(nèi)細胞免疫功能低下，主要表現(xiàn)在CD3+、CD4+T淋巴細胞數(shù)量減少、而CD8+T淋巴細胞比例升高，導致CD4+/CD8+比例失常，使腫瘤患者基礎(chǔ)細胞免疫功能嚴重障礙。樹突狀細胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細胞，激活的DC在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著不可替代的作用，但較多資料表明，腫瘤機體內(nèi)DC表面MHC(主要組織相容性復(fù)合物)-Ⅱ類分子及共刺激分子低表達，常導致其功能缺陷，因此無法有效提呈腫瘤抗原，進而無法有效誘導機體產(chǎn)生

4、細胞毒T淋巴細胞(CTL)，殺傷腫瘤細胞，使機體抗腫瘤免疫反應(yīng)低下或無能。有學者研究認為共刺激分子B7表達降低可能是DC無法有效激發(fā)CTL反應(yīng)的主要原因。 腫瘤細胞自身可以通過多種機制逃避宿主的免疫監(jiān)視功能，這些機制包括①Fas和FasL相互作用導致免疫逃逸；②腫瘤細胞產(chǎn)生和分泌多種免疫抑制因子；③腫瘤細胞表面MHCI類抗原缺失或變異等。Fas和FasL相互作用是細胞凋亡的重要途徑之一。許多腫瘤細胞均可大量表達FasL，當腫瘤細

5、胞與活化的Fas(+)的淋巴細胞接觸時，通過傳遞死亡信號，引起免疫活性細胞凋亡，而腫瘤細胞得以存活，從而實現(xiàn)其免疫逃逸，故又稱為“Fas反擊”。體外實驗也證實FasL表達陽性的肝癌細胞可以通過Fas系統(tǒng)誘導T淋巴細胞凋亡，這可能是導致肝癌組織間質(zhì)浸潤淋巴細胞(TIL)數(shù)量減少，使肝癌增殖局部產(chǎn)生免疫耐受的原因之一。腫瘤細胞自身產(chǎn)生或誘導荷瘤機體產(chǎn)生多種免疫抑制因子如：轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、白細胞介素10(IL-10)、血管內(nèi)皮生

6、長因子(VEGF)等，可導致免疫效應(yīng)細胞的增殖、活化受抑；腫瘤細胞表面MHCI類抗原缺失或變異，使腫瘤細胞不能為T細胞所識別等，這些因素均可導致腫瘤細胞免疫逃逸。 臨床與實驗均已證明許多中醫(yī)藥具有肯定的免疫增強和免疫調(diào)節(jié)作用，枸杞多糖(LBP)是補益類中藥中研究較多，療效肯定的中藥之一。研究已證實LBP有增強機體的免疫功能和顯著的抗腫瘤效應(yīng)，它能從調(diào)動人體自身的抗病能力出發(fā)，在提高機體免疫的同時殺傷腫瘤細胞。研究發(fā)現(xiàn)LBP可促進

7、骨髓有核細胞數(shù)和粒/巨噬細胞集落數(shù)量的增加(CFU-GM)，而DC與單核細胞、粒細胞、T淋巴細胞、NK細胞等具有共同的祖細胞，LBP還可誘導體內(nèi)多種細胞因子的產(chǎn)生，這些因子均有促進免疫活性細胞(包括DC)增殖、分化和成熟的作用，LBP的抗腫瘤作用是否與其對機體以及腫瘤局部的免疫效應(yīng)細胞(T淋巴細胞、DC)數(shù)量及功能恢復(fù)有關(guān)?LBP對腫瘤免疫逃逸機制是否產(chǎn)生影響?目前鮮見此方面的研究報道。因此，本研究應(yīng)用H22肝癌細胞株建立肝癌荷瘤小鼠模

8、型，觀察LBP對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用，從LBP對機體T淋巴細胞和DC的影響以及干預(yù)腫瘤細胞免疫逃逸角度揭示其抗癌作用的免疫學機制。目的：觀察LBP對H22肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用，進一步探討LBP抗癌作用的免疫學機制。 方法：采用H22肝癌荷瘤小鼠模型，LBP分兩個劑量(LBP0.625g/kg.d-1、1.25g/kg.d-1)連續(xù)灌胃治療兩周，每日測定腫瘤直徑大小、計算體積，繪制腫瘤生長體積曲線；所有動物處死后摘取胸

9、腺及腫瘤并稱其質(zhì)量，計算胸腺指數(shù)和腫瘤生長抑制率，并做常規(guī)病理檢查。流式細胞術(shù)檢查各組外周血、腫瘤間質(zhì)浸潤的淋巴細胞(tumor-infiltratinglymphocyte，TIL)中T淋巴細胞數(shù)量及亞群改變；脾臟DC、腫瘤局部浸潤樹突狀細胞(TIDC)數(shù)量及共刺激分子B7-1(CD80)表達的變化。采用ELISA雙抗體夾心法檢測各組血清中VEGF、TGF-β1水平；免疫組織化學方法檢測腫瘤組織FasL及VEGF表達情況。在實驗中設(shè)立

10、正常小鼠LBP用藥組，以對照觀察LBP對正常小鼠免疫功能的影響。 結(jié)果：1LBP抗實驗性肝癌作用及病理定量分析結(jié)果LBP可明顯抑制腫瘤細胞的生長，荷瘤小鼠LBP高、低劑量給藥后，腫瘤生長體積及平均質(zhì)量均有所減低，在高劑量LBP用藥組與腫瘤模型組間比較有顯著性差異(p＜0.05)，腫瘤生長抑制率達到41.12％。經(jīng)過病理定量分析發(fā)現(xiàn)LBP對腫瘤細胞密度、壞死程度有一定的影響，但評分后判定未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異，而核分裂象計數(shù)在LBP用

11、藥后明顯下降、并與腫瘤模型組間比較差異有顯著性，LBP不同劑量用藥后，間質(zhì)纖維組織增生及淋巴細胞浸潤明顯增加，并在荷瘤LBP高劑量組與模型組間比較均具顯著性差異(p＜0.05)。 2LBP抗實驗性肝癌的免疫學機制研究結(jié)果2.1LBP對正常小鼠及H22荷瘤小鼠胸腺的影響正常小鼠服用LBP后，小鼠胸腺質(zhì)量有輕度的增加，但與正常對照組間比較無顯著性差異。腫瘤模型組小鼠胸腺體積縮小，質(zhì)量普遍減輕，胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)分別為0.0637±0

12、.0037(g)，3.42±0.19(×10-3)，與正常對照組及正常用藥組間比較均具顯著性差異，荷瘤LBP低、高劑量用藥后，荷瘤小鼠的胸腺質(zhì)量及指數(shù)均有一定程度的恢復(fù)，在LBP高劑量組與腫瘤模型組比較差異具顯著性(p＜0.05)。 2.3LBP對小鼠DC細胞數(shù)量及功能的影響2.3.1LBP對小鼠脾臟DC細胞數(shù)量及功能的影響腫瘤模型組及荷瘤LBP高、低劑量用藥組，脾臟單個核細胞CD11c+、CD80+及雙陽性細胞比例均較正常對照

13、組升高，且三組中雙陽性細胞比例與正常對照組差異均具顯著性：正常用藥組較正常對照組，以及荷瘤LBP用藥組較腫瘤模型組，CD11c+、CD80+和雙陽性細胞比例亦有所升高，其中，雙陽性細胞比例在荷瘤LBP高劑量組與腫瘤模型組間比較具顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論：本實驗通過腫瘤生長體積曲線及抑瘤率、病理形態(tài)學觀察及定量分析、免疫組織化學、流式細胞術(shù)、ELISA血清學等檢測技術(shù)，觀察了LBP對H22實驗性肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用

14、，并初步探討了其作用機制及靶點，我們得出以下結(jié)論： LBP對H22荷瘤小鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)出明顯的抗移植瘤活性，其抗肝癌作用免疫學機制可能為： 1.通過提高機體整體的免疫功能、發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。主要表現(xiàn)在：1.1LBP可一定程度提高正常及H22荷瘤小鼠的胸腺質(zhì)量及胸腺指數(shù)；1.2LBP可提高正常小鼠及荷瘤小鼠外周血CD4+細胞數(shù)量及CD4+/CD8+比值，同時可以提高荷瘤小鼠腫瘤間質(zhì)中CD4+、CD8+陽

15、性細胞數(shù)量，一定程度恢復(fù)CD4+/CD8+細胞比值； 1.3LBP對提高脾臟組織及腫瘤間質(zhì)中DC細胞數(shù)量，增加B7-1共刺激分子的表達有一定的作用，但還需進一步研究證實。 2.通過以下途徑干預(yù)腫瘤細胞免疫逃逸機制，增強抗腫瘤作用： 2.1LBP可下調(diào)腫瘤細胞表面FasL的表達，減少腫瘤細胞對Fas(+)淋巴細胞的攻擊，減少免疫活性淋巴細胞的凋亡； 2.2LBP可降低腫瘤免疫抑制因子VEGF、TGF-β1的