顱腦損傷繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡中AEP的表達(dá)及其與凋亡因子Casepase-3和Casepase-9表達(dá)相關(guān)性的研究.pdf

1、蛋白酶對(duì)顱腦損傷后繼發(fā)性神經(jīng)元的損傷和凋亡的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，而對(duì)其復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制的研究更可為減輕創(chuàng)傷性腦損傷后病理?yè)p害的程度，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)提供新靶點(diǎn)和新策略。天冬酰胺內(nèi)肽酶（Asparaginyl endopeptidase，AEP）是一種新近發(fā)現(xiàn)的蛋白酶，目前有多項(xiàng)研究報(bào)道AEP可在應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)，且在缺氧條件下可能表達(dá)顯著。同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)AEP在大鼠MCAO模型中可能參與免疫細(xì)胞侵入的機(jī)制。然而，在顱腦損傷方面AEP的功

2、能與分子機(jī)理仍是研究空白。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)研究中采用了小鼠控制性腦皮質(zhì)撞擊模型，并通過GFAP染色和退變神經(jīng)元Fluoro-Jade B組織熒光染色檢測(cè)海馬CA2，CA3區(qū)細(xì)胞凋亡情況，并結(jié)合Western-blot技術(shù)檢測(cè)AEP及凋亡關(guān)鍵因子Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)變化。試圖證明AEP與創(chuàng)傷性顱腦損傷后神經(jīng)元的凋亡相關(guān)，其作用機(jī)制可能通過Caspase-3及Caspase-9等凋亡關(guān)鍵蛋白得以實(shí)現(xiàn)。
　　本實(shí)驗(yàn)分

3、為三部分：第一部分：AEP基因剔除小鼠皮質(zhì)打擊中度損傷模型的建立；第二部分：AEP與中度顱腦損傷小鼠海馬神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡相關(guān)性的研究；第三部分：中度顱腦損傷小鼠繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡中AEP的表達(dá)及其與凋亡因子Caspase-3和Caspase-9表達(dá)相關(guān)性的研究。
　　第一部分：AEP基因剔除小鼠控制性皮質(zhì)打擊損傷模型的建立
　　目的：建立穩(wěn)定的AEP基因剔除（gene knockout，KO）小鼠皮質(zhì)打擊腦損傷（control

4、led cortical impact，CCI）動(dòng)物模型。評(píng)估致傷模型的有效性及傷后腦的改變是否符合實(shí)驗(yàn)要求。為深入開展創(chuàng)傷性顱腦損傷的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：雄性AEP基因剔除的C57Bl/6小鼠40只，隨機(jī)分為：假損傷組(n＝10)；輕度腦損傷組(n＝10)；中度腦損傷組(n＝10)；重度腦損傷組(n＝10)。
　　皮質(zhì)打擊腦損傷AEP基因剔除小鼠模型的建立：各組動(dòng)物均使用

5、直徑3mm的打擊頭，進(jìn)行持續(xù)180ms的打擊，輕度損傷組打擊參數(shù)：打擊速度1.5m/s，打擊深度1mm，中度損傷組打擊參數(shù)：打擊速度3m/s,打擊深度1mm，重度損傷組打擊參數(shù)：打擊速度3m/s，打擊深度2mm。假損傷組小鼠僅做致傷前準(zhǔn)備而不予以打擊。
　　所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在損傷前15分鐘至損傷后4小時(shí)均行各項(xiàng)生理參數(shù)檢測(cè)，每組各4只分別在皮質(zhì)打擊顱腦傷前后完成神經(jīng)反射時(shí)間評(píng)分測(cè)試，另取每組各3只于傷后24h行組織病理學(xué)分析（H&E

6、染色）。
　　結(jié)果：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理參數(shù)均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)無統(tǒng)計(jì)差異。神經(jīng)反射時(shí)間結(jié)果顯示在損傷后隨打擊強(qiáng)度增大，致傷小鼠的反射時(shí)間明顯增加（P<0.01）。組織病理學(xué)分析顯示隨打擊強(qiáng)度增大小鼠致傷灶周圍皮層和海馬腦損傷程度遞增并且神經(jīng)元損傷有明顯差異。
　　結(jié)論：上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該動(dòng)物打擊模型符合臨床上顱腦損傷患者的病理學(xué)改變和病理生理特點(diǎn)。我們成功地建立了AEP基因剔除小鼠皮質(zhì)打擊腦損傷的模型，為下一步探索TBI后AEP

7、的表達(dá)及其與神經(jīng)元凋亡相關(guān)因子CASEPASE-3表達(dá)相關(guān)性的研究提供了良好的基礎(chǔ)條件。
　　第二部分：AEP與顱腦損傷小鼠海馬神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡相關(guān)性的研究
　　目的:探討AEP與顱腦損傷小鼠海馬神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡的相關(guān)性。
　　方法:在前期成功采用CCI打擊裝置，建立AEP基因剔除小鼠腦損傷模型基礎(chǔ)上，小鼠分為4組（n=30/組）：野生型（wild type，WT）假損傷組，野生型損傷組和基因剔除假損傷組,基因剔除損傷

8、組。并通過GFAP染色和退變神經(jīng)元Fluoro-Jade B組織熒光染色檢測(cè),分析海馬CA2，CA3區(qū)域細(xì)胞凋亡情況，以探討AEP與顱腦損傷小鼠海馬神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡的相關(guān)性。
　　結(jié)果：CCI前WT假損傷組與KO假損傷組在CA2，CA3區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞平均密度無顯著差異（P>0.05）,CCI后24h WT損傷組與KO損傷組在CA2，CA3區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞平均密度有顯著差異（P<0.05）。CCI后小鼠打擊同側(cè)CA2，CA3區(qū)域退變神經(jīng)元

9、密度統(tǒng)計(jì)方法同前，KO組小鼠CCI后CA2，CA3區(qū)域退變神經(jīng)元平均密度68.78個(gè)/mm2；WT組小鼠CCI后CA2，CA3區(qū)域退變神經(jīng)元平均密度44.82個(gè)/mm2。WT組和KO組小鼠CCI后CA2，CA3區(qū)域退變神經(jīng)元平均密度有顯著差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：CCI后的繼發(fā)性腦損傷能夠?qū)е聯(lián)p傷同側(cè)海馬CA2，CA3區(qū)域神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AEP基因剔除小鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增加，提示AEP可能與T

10、BI后神經(jīng)元凋亡相關(guān)。
　　第三部分：顱腦損傷繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡中AEP的表達(dá)及其與凋亡因子Casepase-3和Caspase-9表達(dá)相關(guān)性的研究
　　目的：探討顱腦損傷小鼠繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡中AEP的表達(dá)及其與凋亡因子Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的相關(guān)性。
　　方法：在前期發(fā)現(xiàn)AEP與TBI損傷同側(cè)海馬CA2，CA3區(qū)域細(xì)胞凋亡程度相關(guān)的工作基礎(chǔ)上，將雄性C57BL/6小鼠野生型75只隨機(jī)分入5組，0小時(shí)

11、（n=5），0.5小時(shí)組（n=5），1小時(shí)組（n=5），2小時(shí)組（n=5），4小時(shí)組（n=5），每組5只動(dòng)物?？刂菩云べ|(zhì)打擊損傷模型制作、標(biāo)本采集同第一部分，取新鮮標(biāo)本后行Western-blot檢測(cè)各組動(dòng)物AEP的表達(dá)，并重復(fù)三次予以驗(yàn)證。各組動(dòng)物每個(gè)時(shí)間段行Western-blot檢測(cè)AEP在蛋白水平的表達(dá)變化。雄性C57/BL小鼠野生型15只，雄性C57/BL小鼠AEP基因剔除型小鼠15只，隨機(jī)選取不同基因型小鼠各5只，分為兩組。

12、控制性皮質(zhì)打擊損傷模型制作、標(biāo)本采集同第一部分，取新鮮標(biāo)本后行Western-blot檢測(cè)兩組動(dòng)物Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)，并重復(fù)三次予以驗(yàn)證。
　　結(jié)果：AEP在CCI造成WT小鼠中度顱腦損傷后0小時(shí)即有表達(dá)，隨時(shí)間推移AEP的表達(dá)在1h時(shí)明顯降低（p<0.05），在2h時(shí)表達(dá)再次增高，隨時(shí)間延長(zhǎng)至4h時(shí)表達(dá)消失（p<0.05）。CCI后4h時(shí)斷頭取腦。結(jié)果顯示兩組小鼠CCI后均有Caspase-3，Casp

13、ase-9表達(dá)，WT組小鼠CCI后Caspase-3，Caspase-9的活化程度較AEP基因剔除小鼠為低，表達(dá)程度較高(p<0.05)。
　　結(jié)論：本研究證實(shí)在CCI后AEP的表達(dá)與神經(jīng)元的繼發(fā)性凋亡相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)AEP的表達(dá)與凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)程度相關(guān)，提示AEP可能通過對(duì)Caspase-3和Caspase-9的調(diào)控對(duì)神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生抑制作用。因此，本研究為通過多途徑、多機(jī)制而作用于多靶點(diǎn)的腦保