顱腦外傷后繼發(fā)性損傷對神經(jīng)細胞線粒體基因表達的影響.pdf

1、顱腦外傷（traumatic brain injury，TBI）占全身創(chuàng)傷性疾病的第二位，但致死、致殘率則高居第一位。死亡原因除原發(fā)性損傷外，繼發(fā)性損傷也占有很大比重。顱腦外傷后繼發(fā)性腦損害的機制復(fù)雜，在受傷后即刻或數(shù)小時內(nèi)，可出現(xiàn)腦代謝和離子平衡改變，腦水腫和顱內(nèi)壓增高，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放改變，氧自由基的產(chǎn)生等一系列病理生理變化，造成神經(jīng)細胞變性壞死。大量研究證實，傷后數(shù)小時逐漸發(fā)展形成的繼發(fā)性腦缺血，可能是顱腦外傷后腦損傷的主要病理過程

2、。線粒體作為細胞內(nèi)能量生成和儲存的主要場所，對缺血、缺氧極為敏感。隨著學科的發(fā)展和研究水平的不斷提高，國內(nèi)外關(guān)于顱腦外傷后繼發(fā)性損傷與線粒體損傷之間聯(lián)系的認識也在逐步深入。所以，進一步研究顱腦外傷后線粒體的病理生理變化對闡釋繼發(fā)性腦損傷的機制，揭示對病患預(yù)后的影響，指導臨床治療和提高病患生活質(zhì)量都有十分重要的意義。 目的：線粒體氧化磷酸化過程是細胞內(nèi)能量產(chǎn)生的主要來源。一旦受到缺血、缺氧等不利影響而出現(xiàn)線粒體功能障礙將直接影響到

3、細胞整體功能甚至出現(xiàn)細胞壞死、凋亡。本研究針對在線粒體能量代謝（氧化磷酸化）過程中起關(guān)鍵作用的細胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CO）為研究方向。因線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）缺乏細胞核DNA的糾錯、修復(fù)等功能，較核DNA更易受到損傷，故本實驗選取僅由線粒體DNA編碼合成的CO-Ⅰ，CO-Ⅱ，CO-Ⅲ亞單位mRNA作為具體研究指標，觀察顱腦外傷后繼發(fā)性腦損傷對中樞神經(jīng)細胞線粒體

4、DNA轉(zhuǎn)錄表達變化情況，探討其不同時間、部位的變化規(guī)律以及可能出現(xiàn)的機體代償性保護機制。 方法：將44只成年雄性SD大鼠（250-300g）隨機分為對照組（n=4），假手術(shù)組（n=20），外傷組（n=20）。假手術(shù)組和外傷組又分為5個亞組（6小時，1天，3天，5天，7天）。對照組麻醉后處死取檢，假手術(shù)組僅予以右側(cè)頂骨鉆孔術(shù)，外傷組行右側(cè)項骨鉆孔術(shù)和Feeney經(jīng)典自由落體腦外傷模型致局部腦皮層挫裂傷。假手術(shù)組和外傷組按分組情況在

5、不同時間處死取檢。上述操作均在麻醉和無菌條件下進行。利用實時熒光定量PCR技術(shù)分別對腦挫傷灶周圍皮層組織（距挫裂傷灶邊緣2mm，前、后、側(cè)方各取-4mm×1mm×1mm組織塊）和對側(cè)大腦半球挫傷灶對稱部位皮層組織進行檢測，觀察線粒體DNA轉(zhuǎn)錄表達變化情況，并進行數(shù)據(jù)分析。 1．RNA提取; 組織樣品經(jīng)勻漿、兩相分離、離心、沉淀、清洗、再溶解得到RNA溶液，經(jīng)質(zhì)量檢測測定RNA濃度和純度。 2．cDNA合成;

6、 使用樣品的RNA進行cDNA合成。 3．實時定量PCR; 合成的cDNA用于實時定量PCR：（1）制備用于繪制標準曲線的梯度稀釋DNA模板；（2）樣品使用特定的引物進行PCR反應(yīng)，并根據(jù)所得到的PCR產(chǎn)物熔解曲線，計算得出實驗結(jié)果。 結(jié)果：1．大體觀察和預(yù)實驗結(jié)果：實驗中所有44只SD雄性大鼠體重變化無顯著性差異。顱骨鉆孔術(shù)和腦外傷模型制作過程中，所有實驗動物均存活。預(yù)實驗結(jié)果顯示，對照組和假手術(shù)組各亞組的標

7、本檢測值在時間或取檢部位上均無顯著性差異。 2．CO-Ⅰ mRNA含量變化：顱腦外傷后挫裂傷周圍皮層組織CO-Ⅰ mRNA含量在傷后6小時即出現(xiàn)下降（～90．08％），第3天降至最低（～22．02％），后逐漸回升，但至第7天仍明顯低于對照組水平（～51．46％）。傷后24、72、120、168小時組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義。 對側(cè)腦皮層組織CO-Ⅰ mRNA含量在傷后6小時出現(xiàn)短暫升高，傷后第1天降至略低于對照組水平

8、后開始回升，至第5天升至峰值（～119．35％）后再次出現(xiàn)下降，其均值略高于對照組（～102．938％），但各組間差異無統(tǒng)計學意義。 3．CO-Ⅱ mRNA含量變化：腦挫裂傷周圍皮層組織CO-Ⅱ mRNA含量變化趨勢與CO-Ⅰ mRNA變化趨勢相似。相對于對照組，顱腦外傷后6小時傷灶周圍皮層CO-Ⅱ mRNA相對含量即出現(xiàn)下降（～81．95％），傷后3天下降至最低（～18．34％）后逐漸回升，但至傷后第7天仍明顯低于對照組（～4

9、9．25％）。傷后24、72、120小時組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義。 對側(cè)腦皮層組織CO-Ⅱ mRNA含量無明顯下降，其均值略高于對照組（～103．202％）。從傷后6小時開始出現(xiàn)輕度升高，至第3天升達峰值（～116．36％）后下降。各組間差異無統(tǒng)計學意義。 4．CO-ⅢmRNA含量變化：CO-ⅢmRNA含量在腦挫裂傷灶周圍皮層組織中亦下降，總體趨勢與CO-Ⅰ mRNA、CO-Ⅱ mRNA變化趨勢相似，但下降程度更顯

10、著。相對于對照組，顱腦外傷后6小時傷灶周圍皮層CO-ⅢmRNA相對含量即出現(xiàn)下降（～81．89％），傷后第3天下降至最低（～12．01％）后逐漸回升，但至傷后第7天仍明顯低于對照組（～36．06％）。傷后24、72、120、168小時組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義。 對側(cè)腦皮層組織CO-ⅡmRNA平均含量較對照組低（～85．602％），唯第5天短暫升高（～107．09％）后再次降低。各組間差異無統(tǒng)計學意義。 5．結(jié)果分析

11、：顱腦外傷后短時間（6小時）內(nèi)即可觀察到傷側(cè)腦皮層出現(xiàn)線粒體DNA（mtDNA）轉(zhuǎn)錄表達下降。一般傷后第3天降至最低，后逐漸恢復(fù)，但仍明顯低于對照組。對側(cè)腦皮層組織CO-Ⅰ、CO-Ⅱ、CO-ⅢmRNA含量變化趨勢不盡相同。但都出現(xiàn)輕度升高趨勢，一般第3-5天達到峰值后降低。 結(jié)論：1．本實驗利用經(jīng)典顱腦外傷模型實現(xiàn)大鼠局灶性腦挫裂傷并觀察到腦挫裂傷周圍皮層細胞線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、表達存在一定的時間－含量變化規(guī)律； 2．局部

12、腦挫裂傷周圍皮層細胞線粒體基因表達傷后早期（6小時）即出現(xiàn)明顯下降趨勢；至第3天下降至最低后開始逐漸恢復(fù)，但實驗結(jié)果顯示傷后第7天仍明顯低于正常。 3．挫裂傷灶對側(cè)皮層細胞線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、表達水平在傷后3-5天時出現(xiàn)短暫輕度開高。除CO-ⅢmRNA相對含量均值低于正常以外，CO-Ⅰ、CO-ⅡmRNA相對含量基本保持正常水平，未直接受外力打擊，且相隔較遠，但仍出現(xiàn)線粒體基因表達的改變。我們推測，局灶性腦挫裂傷后可能存在全腦病理生