Oligo microarray在PGS中的應(yīng)用及小鼠卵母細(xì)胞非整倍體形成的作用機(jī)制.pdf

1、第一部分、寡核苷酸CGH芯片在人類胚胎植入前篩查中的應(yīng)用
　　研究背景:
　　輔助生殖技術(shù)(ART)已經(jīng)成為治療人類不孕不育的一個(gè)重要手段和途徑。臨床研究發(fā)現(xiàn)，染色體異常胚胎（非整倍體胚胎）的比例高（50-70％），而非整倍體胚胎植入是導(dǎo)致生殖助孕后妊娠率和著床率較低的原因之一，同時(shí)也是導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生的原因。很多報(bào)道指出，在高齡、反復(fù)植入失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、非整倍體妊娠婦女中胚胎非整倍體發(fā)生率非常高。植入前遺傳學(xué)篩查（Pre

2、implantation genetic screening, PGS）技術(shù)，通過(guò)體外受精（In-vitro fertilization, IVF）獲得卵母細(xì)胞或胚胎，經(jīng)活檢遺傳學(xué)分析，選擇正常胚胎移植，可避免遺傳病妊娠發(fā)生，將產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷提前到胚胎植入之前。當(dāng)前，利用PGS技術(shù)可以診斷40多種包括常染色體顯性、隱性及X性連鎖遺傳的變異，該技術(shù)具有重大的優(yōu)生學(xué)意義，也是
　　診斷植入前胚胎非整倍性和其他染色體異常的一種重要手段。

3、隨著PGS技術(shù)的迅速發(fā)展，其在PGS中的應(yīng)用必將越來(lái)越廣泛，未來(lái)將有更多新技術(shù)應(yīng)用于臨床，能有效篩選染色體異常的胚胎，提高輔助生殖技術(shù)成功率。
　　研究目的:
　　把Oligo DNA芯片應(yīng)用于人類胚胎植入前遺傳學(xué)篩查，評(píng)估該芯片在PGS中應(yīng)用價(jià)值，希望用這種新的芯片技術(shù)確定胚胎中微小的染色體異常，從而篩選PGS中染色體正常的胚胎進(jìn)行移植，提高胚胎著床率和臨床妊娠率。
　　研究方法：
　　在本研究中，我們對(duì)進(jìn)行體

4、外受精（IVF）的病人第5/6天的囊胚進(jìn)行活檢，并進(jìn)行Oligo DNA芯片檢測(cè)，結(jié)果異常的囊胚進(jìn)行FISH檢查進(jìn)一步確定Oligo DNA芯片的準(zhǔn)確性。Oligo DNA芯片篩選后正常囊胚進(jìn)行FET，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
　　研究結(jié)果:
　　1、寡核苷酸基因芯片可檢測(cè)到更小的染色體異常片段
　　630K寡核苷酸基因芯片最小可檢測(cè)小至1.3mb大小的異常片段，Oligo基因芯片平臺(tái)比 BAC平臺(tái)靈敏度更高。
　　

5、2、植入前胚胎中非整倍體、部分染色體缺失或重復(fù)發(fā)生率較高
　　全部樣本進(jìn)行基因檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)41.9%為正常整倍體囊胚，58.1%為異常囊胚，219個(gè)異常囊胚中，94個(gè)（42.9%）為單條染色體發(fā)生錯(cuò)誤，101個(gè)（46.1%）為多條染色體發(fā)生錯(cuò)誤，15個(gè)（6.9%）為正常整倍體但某些染色體部分缺失，7個(gè)（3.2%）為正常整倍體但某些染色體部分重復(fù)，2個(gè)（0.9%）為正常整倍體但某些染色體同時(shí)部分缺失和重復(fù)。
　　3、移植正常整倍

6、體囊胚可獲得較高的妊娠率和胚胎著床率。
　　31個(gè)病人進(jìn)行了34次FET，結(jié)果臨床妊娠率為58.8%，胚胎著床率為54.4%。而我們的研究中沒有發(fā)現(xiàn)高齡婦女組與反復(fù)性流產(chǎn)婦女組之間在臨床妊娠率和胚胎著床率方面有明顯差異。
　　4、Oligo基因芯片準(zhǔn)確性評(píng)估
　　我們用10個(gè)已知染色體異常的囊胚進(jìn)一步進(jìn)行FISH檢測(cè)，所有樣本進(jìn)行FISH后結(jié)果均與Oligo基因芯片檢測(cè)結(jié)果相符。
　　研究結(jié)論:
　　1、在

7、高齡患者和/或反復(fù)流產(chǎn)患者植入前囊胚中非整倍體發(fā)生率較高，在高齡患者中非整倍體發(fā)生率更高。
　　2、Oligo基因芯片檢測(cè)可用于檢測(cè)囊胚活檢細(xì)胞的大部分染色體異常，如非整倍體、部分染色體缺失和/或重復(fù)。
　　3、移植芯片檢測(cè)篩查后的囊胚能明顯提高臨床妊娠率和胚胎著床率。
　　4、Oligo基因芯片將來(lái)可在IVF-PGS過(guò)程中可作為常規(guī)手段在更多臨床患者中使用。
　　第二部分、小鼠卵母細(xì)胞非整倍體形成中的作用機(jī)制<

8、br>　　研究背景:
　　輔助生殖技術(shù)解決了包括排卵困難、內(nèi)分泌異常，少、弱精子癥等患者受孕困難的問(wèn)題，然而，大量研究均表明，高齡婦女進(jìn)行輔助受孕后妊娠結(jié)局明顯低于育齡婦女，其關(guān)鍵問(wèn)題在于高齡婦女的卵子出現(xiàn)了不可逆轉(zhuǎn)的老化現(xiàn)象。就目前而言，隨著女性生育年齡不斷推遲，導(dǎo)致卵子老化的問(wèn)題日益嚴(yán)重，同時(shí)也為輔助生殖技術(shù)提出更高要求。有研究表明，衰老卵子其染色體出現(xiàn)非整倍體異常的概率比年輕卵子高。雖然年輕婦女染色體異常低于高齡婦女，但今年

9、來(lái)有上升的趨勢(shì)，環(huán)境因素可能是引起卵子提早衰老的主要原因之一。衰老卵子與卵子非整倍體的形成之間關(guān)系一直沒有得到解決，而造成卵子染色體異常的原因和卵子內(nèi)的超微細(xì)胞器變化的機(jī)理仍然不太清楚。
　　研究目的:
　　從細(xì)胞水平上了解體外成熟培養(yǎng)的卵子其超微結(jié)構(gòu)變化與非整倍體發(fā)生及卵子受精發(fā)育潛能的關(guān)系，并通過(guò)添加重金屬耦合劑和抗氧化劑觀察是否能降低卵子內(nèi)氧化應(yīng)激水平，從而保護(hù)卵子免受氧化應(yīng)激損傷，提高卵子受精發(fā)育能力，在防止卵子老化

10、和為高齡婦女提供輔助生殖策略等方面均有重要的意義。
　　研究方法:
　　1、C57BL/6J小鼠GV期卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)。
　　1.1 GV期卵母細(xì)胞分別置于4個(gè)不同體外成熟培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。A組為添加重金屬耦合劑的IVM培養(yǎng)體系；B組為添加抗氧化劑的IVM培養(yǎng)體系；C組為同時(shí)添加重金屬耦合和抗氧化劑的IVM培養(yǎng)體系；D組為普通IVM培養(yǎng)體系。
　　1.2 4個(gè)體外成熟培養(yǎng)體系的卵母細(xì)胞分別培養(yǎng)12-14小時(shí)、2

11、4-26小時(shí)、46-48小時(shí)。
　　2、卵母細(xì)胞染色體檢查。
　　采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行染色體檢查。
　　3、卵母細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)。
　　采用免疫熒光標(biāo)記JC-1法進(jìn)行細(xì)胞線粒體檢查。
　　4、卵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測(cè)。
　　采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行細(xì)胞ATP含量檢查。
　　5、卵母細(xì)胞紡錘體檢查。
　　采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行紡錘體檢查。
　　6、卵母細(xì)胞受精發(fā)育能力檢查。

12、r>　　對(duì)成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF，計(jì)算2細(xì)胞形成率。
　　研究結(jié)果:
　　1、卵子體外成熟過(guò)程中非整倍體發(fā)生率較高，并隨著時(shí)間增長(zhǎng)而增高，而添加重金屬耦合劑和抗氧化劑對(duì)防止非整倍體形成沒有明顯影響。
　　2、重金屬耦合劑和抗氧化劑影響IVM體外衰老卵子的線粒體活性，提高衰老卵子線粒體活性。
　　3、體外成熟衰老過(guò)程中紡錘體異常率隨時(shí)間變化逐漸增高，重金屬耦合劑和抗氧化劑在可能早期體外培養(yǎng)過(guò)程中能防止異常紡錘體形成

13、。
　　4、卵子內(nèi)ATP濃度隨老化時(shí)間增長(zhǎng)而降低，重金屬耦合劑和抗氧化劑不能明顯提高卵子細(xì)胞內(nèi)ATP含量。
　　5、重金屬耦合劑組和抗氧化劑未能明顯提高M(jìn)II期卵子成熟率，但能提高IVF受精率。
　　研究結(jié)論:
　　1、體外成熟的GV卵子非整倍體發(fā)生率較高，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)非整倍體發(fā)生率越高，而在培養(yǎng)液中加入重金屬耦合劑和抗氧化劑培養(yǎng)未能降低其非整倍體發(fā)生率。
　　2、衰老卵子超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，重金屬耦合劑