SM22α調(diào)制血管氧化應(yīng)激的機(jī)制和意義.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖和肥大是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等血管重塑性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活以及由此產(chǎn)生的血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用?；钚匝?reactive oxygenspecies，ROS)作為重要的信號分子參與介導(dǎo)了AngⅡ引發(fā)的諸多病理生理過程。VSMCs是血管ROS生成的主要來源，

2、NADPH氧化酶是催化ROS生成的關(guān)鍵酶，其活性受p47phox亞基的調(diào)節(jié)，后者在AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC ROS合成中扮演重要角色。在心血管系統(tǒng)中，AngⅡ引發(fā)的分子和細(xì)胞事件幾乎都是通過血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensinⅡ type1receptors，AT1R)介導(dǎo)的。作為AT1R下游的信號分子，蛋白激酶C(PKC)是AngⅡ誘導(dǎo)的諸多胞內(nèi)信號途徑交互聯(lián)系的關(guān)鍵樞紐，含有多種亞型。其中，PKC8是大鼠VSMC表達(dá)的主要亞型

3、之一。然而其在AngⅡ誘導(dǎo)的ROS生成中的作用尚不明確。
　　有關(guān)血管氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)機(jī)制已有很多理論觀點(diǎn)，但是功能性蛋白在調(diào)控VSMC ROS合成中的作用和分子機(jī)制研究尚少。平滑肌22 alpha(smooth muscle22 alpha，SM22α)是一種actin相關(guān)蛋白，特異表達(dá)于成熟的SMC中。近期的研究表明，SM22α缺失可通過激活ROS介導(dǎo)的NF-κB途徑而參與血管炎癥反應(yīng)。但其激活ROS產(chǎn)生的作用機(jī)制尚不清楚。

4、r>　　方法：本文假設(shè)，SM22α功能失調(diào)可能參與AngⅡ誘導(dǎo)的血管氧化應(yīng)激。本研究從分子、細(xì)胞和整體水平上，考察AngⅡ?qū)SMCs中SM22α表達(dá)和功能的影響，以及與ROS生成、VSMC增殖和肥厚的關(guān)系；利用蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)，探討SM22α對PKC6-p47phox通路激活的影響及信號調(diào)節(jié)機(jī)制；進(jìn)而，分別用血管肥厚模型和內(nèi)膜增生模型驗(yàn)證體外研究的發(fā)現(xiàn)。旨在為血管重塑性疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，為心血管疾病的防治提供新的靶

5、點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1 SM22α表達(dá)下調(diào)加劇AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC氧化應(yīng)激
　　1.1 AngⅡ引發(fā)的SM22α表達(dá)下調(diào)促進(jìn)ROS的合成
　　Western blot結(jié)果表明，AngⅡ以時(shí)間依賴方式抑制SM22α表達(dá)，24h時(shí)抑制作用最強(qiáng)。DHE染色和TBA分析結(jié)果表明，AngⅡ誘導(dǎo)的ROS合成呈現(xiàn)雙峰模式，峰值分別出現(xiàn)在0.5-1 h和24 h。利用小干擾RNAsiSM22α特異性敲低VSMC內(nèi)源性SM22

6、α后，ROS合成增加，而利用腺病毒Ad-GFP-SM22α感染VSMCs使外源性SM22α過表達(dá)后，ROS合成下降。結(jié)果表明，AngⅡ引發(fā)的SM22α表達(dá)下調(diào)促進(jìn)了VSMC ROS的合成。
　　1.2 SM22α表達(dá)下調(diào)促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的p47phox激活
　　免疫沉淀結(jié)果顯示，AngⅡ刺激VSMCs10 min，p47phox磷酸化達(dá)峰值；免疫熒光和亞細(xì)胞組分分離結(jié)果顯示，AngⅡ短時(shí)刺激可誘導(dǎo)胞漿p47phox發(fā)生膜轉(zhuǎn)位

7、。提示參與AngⅡ誘導(dǎo)的ROS合成。進(jìn)一步分析顯示，敲低SM22α可促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的p47pbox磷酸化，而過表達(dá)SM22α抑制該過程。結(jié)果表明，SM22α表達(dá)下調(diào)通過促進(jìn)p47phox激活而增強(qiáng)AngⅡ誘導(dǎo)的ROS合成。
　　2 AngⅡ誘導(dǎo)的SM22α磷酸化是PKCδ-p47phox軸激活所必需的
　　2.1磷酸化SM22α介導(dǎo)PKCδ與p47phox的相互作用
　　為了揭示SM22α在AngⅡ誘導(dǎo)的p47pho

8、x快速磷酸化中的作用，基于SM22α分子中存在的三個(gè)可能磷酸化位點(diǎn)，首先檢測了AngⅡ短時(shí)刺激對SM22α磷酸化的影響。免疫沉淀結(jié)果顯示，AngⅡ刺激10-30 min時(shí)，SM22α磷酸化水平達(dá)到峰值。隨后，分別利用SM22α野生型、強(qiáng)制磷酸化突變體S181D、和磷酸化失活突變體S181A腺病毒感染細(xì)胞，結(jié)果顯示，SM22α和S181A，而不是S181D顯著抑制AngⅡ短時(shí)刺激引發(fā)的p47phox磷酸化和膜轉(zhuǎn)位，提示SM22α S181

9、磷酸化有利于p47phox活化。為了闡明SM22α調(diào)控p47phox活性的分子機(jī)制，進(jìn)而檢測SM22α與p47phox和PKCδ的相互關(guān)系。免疫共沉淀結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)下，SM22α與PKCδ結(jié)合。AngⅡ刺激10 min后，隨著PKCδ磷酸化激活，其與SM22α解離，轉(zhuǎn)而與p47phox相互作用，伴隨發(fā)生SM22α和p47phox磷酸化。免疫雙熒光定位分析也證實(shí)了這一點(diǎn)。
　　為了證實(shí)SM22α磷酸化促使其與PKCδ解離，分別將

10、野生型SM22α和磷酸化位點(diǎn)突變體S181D，S181A轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞。免疫沉淀結(jié)果顯示，PKCδ與S181A的親和力明顯高于S181D；過表達(dá)SM22α或S181A，司明顯抑制PKCδ與p47phox的相互作用。GST-pull down結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。
　　為了確定SM22α在AngⅡ長效刺激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的作用，用AngⅡ處理VSMC24 h，或利用siRNA敲低內(nèi)源性SM22α，觀察對p47phox活性的影響

11、。免疫沉淀結(jié)果表明，AngⅡ長效刺激或敲低SM22α表達(dá)均促進(jìn)PKCδ與p47phox相互作用和p47phox激活。
　　結(jié)果表明，SM22α Ser181磷酸化或表達(dá)下調(diào)分別參與AngⅡ誘導(dǎo)的快速和遲發(fā)的氧化應(yīng)激，其作用機(jī)制與促進(jìn)PKCδ-p47phox途徑激活有關(guān)。
　　2.2 AT1R-PKCδ途徑介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的SM22αS181磷酸化
　　為了揭示介導(dǎo)SM22α S181磷酸化的上游信號通路，分別以AT1R

12、拮抗劑纈沙坦、PKC激動(dòng)劑佛波酯和抑制劑十字苞堿、PKCα/B選擇性抑制劑Go6976、PKCδ選擇性抑制劑Rottlerin或PKCδ特異性小干擾RNA處理VSMCs。結(jié)果顯示，AngⅡ通過AT1R激活PKCδ，后者參與介導(dǎo)了AngⅡ誘導(dǎo)的SM22α S181磷酸化。上述發(fā)現(xiàn)表明，SM22α是PKCδ的一個(gè)新的作用底物。
　　2.3 SM22α下調(diào)可通過細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)而促進(jìn)PKCδ-p47phox軸激活
　　為探討SM22

13、α調(diào)制AngⅡ長效刺激誘導(dǎo)ROS生成的作用機(jī)制，本研究首先考察AngⅡ長效刺激對SM22α泛素化降解的影響。免疫沉淀結(jié)果表明，AngⅡ能以時(shí)間依賴的方式促進(jìn)SM22α泛素化，4 h時(shí)泛素化水平最高。PKCδ選擇性抑制劑Rottlerin可明顯削弱AngⅡ引發(fā)的SM22α泛素化；重組腺病毒感染分析顯示，與S181D相比，S181A顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的SM22α泛素化；293A細(xì)胞株轉(zhuǎn)染分析得到相似的結(jié)果。上述發(fā)現(xiàn)表明，AngⅡ通過誘導(dǎo)S

14、M22α磷酸化而加速其泛素化降解。
　　為了確定SM22α缺失對細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的影響，分步提取G-actin和F-actin，Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ刺激VSMCs24 h后，隨著SM22α水平的降低，F(xiàn)-actin/G-actin比值下降，表明AngⅡ長期刺激能促進(jìn)細(xì)胞骨架解聚。為了進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)對ROS合成的影響，分別以細(xì)胞松弛素B處理VSMCs。免疫沉淀結(jié)果表明，細(xì)胞骨架解聚促進(jìn)PKCδ-p47p

15、hox軸激活以及p47phox的活化，而細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑JPK抑制了該過程。結(jié)果表明，AngⅡ長效刺激導(dǎo)致的SM22α下調(diào)可通過加速細(xì)胞骨架解聚而促進(jìn)PKCδ-p47phox軸激活和ROS生成。
　　3 SM22α磷酸化介導(dǎo)的ROS生成參與VSMC肥大和增殖的調(diào)節(jié)
　　3.1 SM22α磷酸化與VSMC增殖和肥大成正相關(guān)關(guān)系
　　5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)摻入和單位細(xì)胞蛋白含量分析結(jié)果顯示，SM22α磷酸化促進(jìn)An

16、gⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖和肥大；反之，抑制SM22α磷酸化，則可在一定程度上降低細(xì)胞增殖和肥大活性。
　　3.2 SM22α磷酸化在血管肥厚和內(nèi)膜增生中發(fā)揮重要作用
　　將含有AngⅡ的Alzet微滲透泵植入大鼠皮下，持續(xù)給予AngⅡ刺激，建立大鼠高血壓模型；同時(shí)，在體頸總動(dòng)脈分別導(dǎo)入SM22α、S181D和S181A，觀察對AngⅡ誘發(fā)的血管肥大和ROS生成的影響。模型成功后，取頸總動(dòng)脈切片，HE染色結(jié)果顯示，Ad-GFP-

17、SM22α和Ad-GFP-S181A組的血管中膜增厚及橫截面積增大程度明顯減弱；免疫組化染色可見，氧化應(yīng)激的標(biāo)志物4-HNE也明顯減少。結(jié)果表明，過表達(dá)SM22α或抑制其磷酸化可抵抗AngⅡ誘發(fā)的血管肥大及ROS合成。利用大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷模型，同樣發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SM22α和非磷酸化突變體S181A可抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管ROS合成及新生內(nèi)膜形成。
　　總之，SM22α通過調(diào)制氧化應(yīng)激而在VSMC肥大和增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。靶向SM2