假單胞菌喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)抑制劑的篩選與研究.pdf

1、臨床細(xì)菌的耐藥性成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重大課題。隨著科學(xué)研究的深入，細(xì)菌的群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)并逐漸闡明，其對(duì)細(xì)菌感染能力具有重要作用。通過抑制細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)可以有效降低細(xì)菌的感染能力，并且不會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長產(chǎn)生威脅，從而避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種機(jī)會(huì)致病菌，對(duì)肺囊性纖維化等免疫缺陷型病人感染率很高。喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)(Pseudomonas q

2、uinolone signal system，pqs)是銅綠假單胞菌群體感應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重要組成部分，其相關(guān)信號(hào)分子是細(xì)菌種間交流的媒介，但目前對(duì)該系統(tǒng)研究相對(duì)較少。本文構(gòu)建了針對(duì)銅綠假單胞菌喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)的抑制劑篩選模型體系，目的是從中藥粗提物中篩選得到較好的群體感應(yīng)抑制劑，為開發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。
　　本文構(gòu)建了針對(duì)銅綠假單胞菌喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)的抑制劑篩選菌株P(guān)QSI1，其由野生型銅綠假單胞菌PAOI與質(zhì)粒pPQSI1構(gòu)成。質(zhì)粒

3、pPQSI1由長度344bp的PpqsA啟動(dòng)子及蔗糖致死基因（sacB）組成。基因組表達(dá)的調(diào)控蛋白PqsR與信號(hào)分子PQS形成的活性復(fù)合物可以啟動(dòng)sacB基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡;在群體感應(yīng)抑制劑存在條件下，sacB基因不能表達(dá)，細(xì)菌無蔗糖致死現(xiàn)象。通過測(cè)定細(xì)菌密度來表征化合物的群體感應(yīng)抑制活性，菌液密度越高則化合物抑制活性越大。這種液體篩選體系具有經(jīng)濟(jì)及操作簡便的特點(diǎn)，可用于高通量篩選群體感應(yīng)抑制物。由于篩選得到的抑制物通常為粗提物，所

4、以本文同時(shí)構(gòu)建了可以追蹤抑制劑的菌株P(guān)QSI2。模型質(zhì)粒pPQSI2由長度為493bp的PpqsA啟動(dòng)子及下游sacB基因組成。利用薄層層析技術(shù)將陽性粗提物中化合物進(jìn)行分離，將混有PQSI2菌液的固體培養(yǎng)基鋪在薄層板表面培養(yǎng)。通過直接觀察活細(xì)菌位置可以判定群體感應(yīng)抑制劑在薄層板上的位點(diǎn)。這種生物自顯影技術(shù)具有直觀性的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將高通量篩選模型PQSI1與生物自顯影模型PQSI2相結(jié)合，形成了一套有效獲得群體感應(yīng)抑制劑的模型體系。

5、>　　本文利用高通量液體篩選模型PQSI1對(duì)50多種中藥提取物進(jìn)行群體感應(yīng)抑制活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羌活、厚樸及大葉紫珠等10種中藥粗提物的抑制活性較好，其中羌活群體感應(yīng)抑制活性最佳。利用減壓硅膠柱色譜、SephadexLH-20凝膠柱色譜及高效液相色譜技術(shù)，并結(jié)合生物自顯影模型PQSI2對(duì)群體感應(yīng)抑制劑進(jìn)行追蹤分離，得到純度在98％以上的群體感應(yīng)抑制活性化合物。經(jīng)陽離子質(zhì)譜及核磁譜鑒定抑制活性化合物為法卡林二醇。在亞抑菌濃度范圍內(nèi)，法卡林二醇

6、對(duì)銅綠假單胞菌毒力因子彈性蛋白酶、綠膿菌素和鼠李糖脂等產(chǎn)量具有較好的抑制活性;在10μM濃度下其對(duì)綠膿菌素產(chǎn)量抑制程度可以達(dá)到70％。法卡林二醇不僅對(duì)銅綠假單胞菌swarming運(yùn)動(dòng)具有較好的抑制效果，而且在20μM濃度下其對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的降低程度達(dá)60％。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明法卡林二醇可以有效抑制銅綠假單胞菌las、rhl和pqs群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　本實(shí)驗(yàn)研究首次成功構(gòu)建了用于銅綠假單胞菌