尋找慢性移植腎失功患者血清標(biāo)志物及對候選標(biāo)志物Galectin-7的初步研究.pdf

1、目的：慢性移植物失功（chronic allograft dysfunction，CGD）是影響移植腎長期存活的最重要的因素，但是它準(zhǔn)確的診斷、發(fā)病機(jī)制和治療措施還不十分明確。腎移植后診斷慢性移植物失功最可靠的方法是腎穿刺活檢，但這種侵入性的診斷方法存在一些并發(fā)癥，嚴(yán)重的可造成患者死亡。本研究的目的是利用蛋白組學(xué)二維差異性凝膠電泳（two-dimensional differential in-gel electrophoresis，2

2、-D DIGE）和反相高效液相色譜法（reversed phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）聯(lián)合電噴射離子化質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry mass spectrometry，ESI/MS）技術(shù)尋找慢性移植腎失功患者血清生物標(biāo)志物，并對找到的血清候選標(biāo)志物半乳糖苷凝集素-7（Galectin-7）在慢性移植物失

3、功患者移植腎組織的表達(dá)以及其對免疫功能的影響進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　 方法：1、血清樣本分成4組：慢性移植物失功組（CGD）、移植后長期腎功能穩(wěn)定組（long-term stable renal function，SRF）、急性排斥組（acute rejection，AR）和健康對照組（normal volunteer，N）。血清樣本經(jīng)多重親和吸附柱去除高豐度蛋白處理后，使用2-D DIGE技術(shù)找到差異蛋白點(diǎn)。切下這些差異蛋白

4、點(diǎn)，胰蛋白酶消化，經(jīng)RP-HPLC-ESI/MS分析鑒定，在另一獨(dú)立樣本中對鑒定出的差異蛋白Galectin-7和Clusterin進(jìn)行了ELISA驗(yàn)證；2、利用免疫組化的方法對慢性移植物失功（CGD），移植后長期腎功能穩(wěn)定（SRF）和急性排斥（AR）患者移植腎活檢標(biāo)本Galectin-7的表達(dá)進(jìn)行了檢測；3、在體外利用不同濃度（0.2μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL）的重組Galectin-7蛋白在有或無抗CD

5、3和CD28抗體存在時(shí)與純化的小鼠T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)5天，流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞及各亞群的增殖情況。在體外利用另一濃度梯度（2ng/mL，4ng/mL，8ng/mL，20ng/mL，200ng/mL）的重組Galectin-7蛋白與純化的小鼠T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)4小時(shí)和24小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞的早期凋亡和中晚期凋亡的情況。
　　 結(jié)果：1、慢性移植物失功（CGD）組與其它三組比較，血清中的差異表達(dá)蛋白有39個(gè)，質(zhì)譜鑒定

6、出22個(gè)差異表達(dá)蛋白，包括載脂蛋白A-I前體、補(bǔ)體C4-A前體、補(bǔ)體H因子相關(guān)蛋白1前體、補(bǔ)體C9 前體、Galectin-7、Clusterin前體、hornerin、β2糖蛋白1前體等。ELISA結(jié)果提示，慢性移植物失功（CGD）患者血清中Galectin-7的表達(dá)較移植后長期腎功能穩(wěn)定（SRF）患者和健康志愿者（N）有明顯增高，慢性移植物失功（CGD）患者血清中Clusterin的表達(dá)較移植后長期腎功能穩(wěn)定（SRF）患者有明顯增高

7、。2、在慢性移植物失功（CGD）患者移植腎活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)萎縮的腎小管上皮細(xì)胞的胞漿有Galectin-7的高表達(dá)，并且慢性移植物失功（CGD）組腎活檢標(biāo)本每個(gè)高倍視野下Galectin-7陽性細(xì)胞數(shù)較移植后長期腎功能穩(wěn)定（SRF）組和急性排斥（AR）組明顯增多；3、體外研究發(fā)現(xiàn)，重組Galectin-7蛋白（0.2μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL）能明顯誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖，在與抗CD3和抗CD28抗體聯(lián)用時(shí)

8、能協(xié)同促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，增殖的細(xì)胞主要為CD8+T淋巴細(xì)胞；重組Galectin-7蛋白（2ng/mL，4ng/mL，8ng/mL，20ng/mL，200ng/mL）在與小鼠T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)和24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)Galectin-7對T淋巴細(xì)胞的早期凋亡和中晚期凋亡均無影響。
　　 結(jié)論：移植腎慢性移植物失功患者血清中有一組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，可區(qū)別于移植后長期腎功能穩(wěn)定、急性排斥者和健康對照者，這些血清差異蛋白具有不同的生物