隱孔菌發(fā)酵物及多糖的制備與抗炎活性的研究.pdf

1、隱孔菌為隱孔菌科隱孔菌的子實(shí)體，有舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)除濕的功效，在民間用于治療氣管炎和哮喘。隱孔菌早在公元15世紀(jì)《滇南本草》就有記載。因該菌為腐生真菌，生態(tài)環(huán)境嚴(yán)格，以致蘊(yùn)藏量少，資源緊缺，故采用發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)來獲得隱孔菌的新藥研發(fā)資源。通過與野生隱孔菌比較，發(fā)酵培養(yǎng)獲得的隱孔菌的化學(xué)成分和理化性質(zhì)基本上與野生隱孔菌相似。經(jīng)過一系列藥理和急性、慢性毒性研究證實(shí)，隱孔菌發(fā)酵物(CFS)有明顯的抗炎平喘作用，無明顯毒性反應(yīng)，是一種很好的治療哮喘

2、的中藥新藥。 本論文共分以下4部分工作： 1、隱孔菌發(fā)酵物的制備與抗炎活性研究：研究隱孔菌發(fā)酵物的制備工藝，明確其抗過敏性炎癥的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隱孔菌發(fā)酵的適宜培養(yǎng)基組成為：碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨、酵母膏，并添加磷酸鹽、硫酸鎂等無機(jī)鹽，調(diào)pH值至4.8～5.0。培養(yǎng)條件為27～28℃，140r/min，搖床振蕩培養(yǎng)4～5天。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基各組成成分的最佳比例：葡萄糖2.0％、蛋白胨0.5％、酵母膏0.3

3、％、KH2PO40.1％。發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)3～5天時(shí)，還原糖降至0.6％左右，pH降至3.8左右，且菌絲濃度≥27％，即可終止發(fā)酵。上述指標(biāo)可作為對發(fā)酵終點(diǎn)控制的指標(biāo)。隱孔菌發(fā)酵工藝研究，建立了隱孔菌發(fā)酵最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，為隱孔菌發(fā)酵物的穩(wěn)定生產(chǎn)提供依據(jù)。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CFS灌胃給藥呈劑量依賴抑制致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺泡灌流液中嗜酸性粒細(xì)胞升高，明顯抑制嗜酸性粒細(xì)胞的聚集反應(yīng)，同時(shí)也證明了CFS中有可被胃腸吸收的有效成份

4、。 2、隱孔菌發(fā)酵物有效成分的藥理篩選：研究隱孔菌發(fā)酵物中生物堿類物質(zhì)、有機(jī)酸類物質(zhì)和多糖類物質(zhì)的抗炎作用，尋找隱孔菌發(fā)酵物中具有抗炎藥理作用的活性化學(xué)成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用稀鹽酸與生物堿反應(yīng)生成鹽的原理提取隱孔菌發(fā)酵物中總生物堿，每100g發(fā)酵物中含有生物堿0.13～0.20g；用乙酸乙酯提取隱孔菌發(fā)酵物中總有機(jī)酸，每100g發(fā)酵物中含有有機(jī)酸1.2～4.0g；用水提和乙醚脫酯法提取隱孔菌發(fā)酵物中總多糖，每100g發(fā)酵物中含

5、有粗多糖2.0～6.5g。用大鼠哮喘模型的嗜酸性粒細(xì)胞為指標(biāo)篩選這3個(gè)部分的作用，結(jié)果顯示多糖成分的作用較強(qiáng)，作用強(qiáng)度依次為粗多糖＞發(fā)酵物＞生物堿＞有機(jī)酸。因此認(rèn)為值得進(jìn)一步深入多糖成分的研究。 3、隱孔菌多糖的制備及抗炎作用強(qiáng)度的藥效研究：對隱孔菌多糖(CP)進(jìn)行了純化制備、含量測定、分子量分布研究，考察純化隱孔菌多糖對致敏小鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中的炎癥細(xì)胞的作用，并采用灌胃和靜脈注射兩種給藥途徑，通過藥效比較初步闡明隱

6、孔菌多糖的生物利用度和作用強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用PEG沉淀多糖的提取方法，硫酸-蒽酮法測定隱孔菌多糖含量達(dá)到87％，從高效液相的分子量分布圖來看，隱孔菌多糖含有一個(gè)不同于培養(yǎng)基的特征峰，分子量范圍為2000～200000。色譜條件：G2000SWxl柱，流動相為0.7％硫酸鈉溶液，流速0.5ml/min，柱溫29℃，進(jìn)樣3μl，示差檢測器。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)純化隱孔菌多糖不同給藥方式以及不同給藥劑量對小鼠哮喘模型支氣管肺泡的炎癥細(xì)胞聚集有明顯

7、的抑制作用。CP2mg/kgiv，10mg/kgiv均能顯著抑制嗜酸性粒細(xì)胞在支氣管肺泡內(nèi)聚集(P＜0.01～0.001)。CP灌胃給藥的抗炎作用強(qiáng)度約為靜脈注射給藥的20～40％，同等劑量CP靜脈注射作用強(qiáng)度約為灌胃給藥的2.5～5倍。以上結(jié)果提示，CP可進(jìn)一步純化，經(jīng)還原主要單糖為巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖。純化的CP抗炎作用明顯強(qiáng)于隱孔菌發(fā)酵物。 4、隱孔菌多糖對小鼠哮喘模型抗炎作用機(jī)制的初步探討：研究小鼠抗原攻擊后肺組

8、織嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)mRNA以及α-腫瘤壞死因子(TNF-α)mRNA表達(dá)的時(shí)程關(guān)系以及CP對表達(dá)的影響，初步探討CP對小鼠哮喘模型抗炎作用的機(jī)制。采用半定量RT-PCR法測定肺組織eotaxinmRNA和TNF-αmRNA表達(dá)，并通過觀察支氣管肺灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目驗(yàn)證eotaxin和TNF-αmRNA表達(dá)增多的功能。研究結(jié)果表明，致敏小鼠抗原攻擊8h后肺組織TNF-αmRNA表達(dá)和2

9、4h后eotaxinmRNA表達(dá)達(dá)到高峰，與對照小鼠比較明顯增多，BALF中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目相應(yīng)增加。隱孔菌多糖CP3、10、30mg·kg-1呈劑量依賴抑制TNF-α和eotaxinmRNA表達(dá)以及炎癥細(xì)胞在氣道的聚集。所以隱孔菌多糖抑制肺組織TNF-α和eotaxinmRNA表達(dá)可能是其抗過敏性炎癥的作用機(jī)制。 結(jié)論： 1、通過發(fā)酵工藝優(yōu)化研究，為得到穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的隱孔菌發(fā)酵物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。藥理實(shí)驗(yàn)表明隱