人臍帶間質干細胞來源的exosomes預防順鉑誘導的HK-2細胞損傷的實驗研究.pdf

1、目的:建立人臍帶間質干細胞來源的exosomes(hucMSC-Ex)預防順鉑誘導的HK-2細胞損傷模型，評價其對順鉑誘導的HK-2細胞損傷的預防保護作用。通過對自噬相關分子的分析檢測，探討細胞自噬作用在其中發(fā)揮的重要作用，并初步闡明hucMSC-Ex預防順鉑誘導的HK-2細胞損傷的相關分子作用機制。
　　方法:收集無血清培養(yǎng)的人臍帶間質干細胞(hucMSCs)和人成纖維細胞(HFL1)的培養(yǎng)上清，以ExoQuick-TCTM試劑

2、盒分離純化兩種細胞來源的exosomes。透射電子顯微鏡和Nanosight納米顆粒示蹤技術觀察exosomes的形態(tài)大小，免疫膠體金技術、流式細胞術和Western Blot技術檢測其生物學標記。構建hucMSC-Ex預防順鉑誘導的人腎小管上皮細胞（HK-2）損傷模型，分組設置為:正常對照（Normal）組、Cisp+PBS組、Cisp+hucMSC-Ex組和Cisp+HFL1-Ex組。預先加入hucMSC-Ex處理，然后經(jīng)順鉑誘導處

3、理16h后收集細胞標本;Western Blot，TUN EL，免疫熒光、流式細胞術以及MTT等技術分別檢測HK-2細胞的增殖、凋亡和自噬等相關指標。提取細胞RNA，然后逆轉錄為cDNA并利用qRT-PCR技術檢測HK-2細胞自噬相關基因的表達情況。提取exosomes中的miRNAs，并利用qRT-PCR技術檢測hucMSC-Ex和HFL1-Ex中的miRNAs;同時提取hucMSC-Ex預處理的于不同時間點經(jīng)順鉑誘導HK-2細胞的m

4、iRNAs，檢測其中miR-155的表達。
　　結果:透射電子顯微鏡和Nanosight分析發(fā)現(xiàn)分離純化的hucMSC-Ex呈圓形，免疫電鏡、流式細胞術和Western Blot檢測CD9、CD81、CD63以及CD44等exosomes相關標記蛋白。HK-2細胞經(jīng)順鉑處理后，細胞形態(tài)由圓形或橢圓形變?yōu)槔w維狀或梭形;同時凋亡蛋白Bax的表達在一定范圍內隨著順鉑濃度以及作用時間的增加而增加。hucMSC-Ex預處理HK-2細胞后，結

5、果顯示hucMSC-Ex能促進順鉑誘導的HK-2細胞增殖蛋白PCNA的表達，細胞增殖能力有所增強;促進抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2以及細胞周期蛋白Cyclin D1的表達;抑制HK-2細胞凋亡蛋白Bax的表達和TUNEL陽性細胞數(shù)目增多;同時也促進了PI3K/AKT通路相關蛋白PI3K和AKT蛋白的表達;相應地，hucMSC-Ex頇處理HK-2細胞后，細胞自噬相關基因ATG5和ATG7的表達上調，自噬相關蛋白LC-3B和Becli

6、n1的表達增強;然而自噬內源性抑制分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）的活化卻受到相應的抑制，而HFL1-Ex預處理后則無明顯的上述作用。QRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex和HFL1-Ex表達miR-99a-5p和miR-155。順鉑誘導HK-2細胞后，miR-155在四個時間組中的表達明顯增強，而hucMSC-Ex預處理后，miR-155在4h時表達明顯上調。