腫瘤細(xì)胞來(lái)源的exosomes促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究.pdf

1、目的： 惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，在各種疾病所致的死亡中，惡性腫瘤已成為主要病因，并有進(jìn)一步增高的趨勢(shì)。目前傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)、放療和化療雖有一定療效，但卻十分有限，常難以徹底消滅腫瘤細(xì)胞。而免疫治療特別是腫瘤疫苗的研究日益受到人們的重視，顯示出良好的應(yīng)用前景，為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望，其中exosomes亞細(xì)胞疫苗的研制成為目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一。 Exosomes是由細(xì)胞分泌至胞外的膜性小囊泡，人們?cè)缬?9

2、87年發(fā)現(xiàn)exosomes，但是直至最近幾年有關(guān)exosomes基礎(chǔ)與臨床的研究才得到更多的關(guān)注，這主要?dú)w因于它的抗腫瘤作用的發(fā)現(xiàn)。目前，exosomes的研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段，對(duì)其功能有了更多的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)其作用并不限于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以及抗腫瘤作用，此外還能夠誘導(dǎo)免疫耐受。因此，研究腫瘤來(lái)源的exosomes對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響及其在免疫方面的作用機(jī)制可為腫瘤的免疫治療提供理論依據(jù)。 磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyli

3、nositol3—kinase，PI3K)/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated protein kinase，MAPK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal—regulated protein kinase，ERK)在維持細(xì)胞生存和抑制細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但PI3K/Akt和MAPK/ERK通路在exosomes促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和

4、誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。 Cbl家族蛋白(Cbl—b和c—Cbl)是一種高度保守的RING家族E3泛素連接酶，在維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和免疫耐受方面發(fā)揮著重要作用。研究表明它不僅能設(shè)定T細(xì)胞活化的閾值，而且能通過(guò)特異性地選擇底物蛋白啟動(dòng)泛素化降解途徑而參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明E3泛素連接酶Cbl—b(Casitas B lineage lymphoma—b)在T細(xì)胞CD3激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中起

5、重要作用，但關(guān)于Cbl蛋白在exosomes誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡中的作用不清楚。 本課題以胃癌SGC7901細(xì)胞為模型，分離出腫瘤細(xì)胞來(lái)源的exosomes，初步觀察了其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和T細(xì)胞凋亡的影響，并對(duì)PI3K/Akt、MAPK/ERK通路及其上游分子泛素連接酶Cbl家族蛋白在此過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討。 材料與方法： 1、采用離心超濾和蔗糖密度梯度離心的方法從胃癌SGC7901細(xì)胞的上清液中分離出腫瘤來(lái)源的

6、exosomes。 2、透射電子顯微鏡下觀察exosome形態(tài)。 3、采用MTT法和臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞活力，繪制增殖曲線(xiàn)。 4、采用流式細(xì)胞儀PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 5、采用瑞氏—姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 6、采用Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

7、 1、采用離心超濾和蔗糖密度梯度離心的方法從胃癌SGC7901細(xì)胞的上清液中分離出腫瘤來(lái)源的exosomes。透射電子顯微鏡下觀察exosomes具有特征性的盤(pán)狀結(jié)構(gòu)，由雙層膜構(gòu)成，它們的直徑在30-100 nm之間。Western blot結(jié)果顯示和等量的SGC7901細(xì)胞裂解物相比，exosomes表面富含HLA—A、CD9和TSG101分子。 2、SGC7901細(xì)胞來(lái)源的exosomes以時(shí)間和劑量依賴(lài)性的方式促進(jìn)SGC

8、7901細(xì)胞和BGC823細(xì)胞的增殖。200μg/ml和400μg/ml的exosomes處理SGC7901細(xì)胞72h，細(xì)胞的增殖比率分別是對(duì)照組的142％和145％；處理BGC823細(xì)胞72h，細(xì)胞的增殖比率分別是對(duì)照組的129％和138％。 3、Exosomes以時(shí)間和劑量依賴(lài)性的方式上調(diào)p—Akt和p—ERK1/2的表達(dá)，200μg/ml的exosomes作用于SGC7901細(xì)胞72h后，p—Akt和p—ERK1/2的表達(dá)

9、水平分別是對(duì)照組的3.52和3.16倍。10μM LY294002預(yù)處理SGC7901細(xì)胞1h阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的活性后，再加入200μg/ml的exosomes繼續(xù)作用72h，能使p—Akt的表達(dá)恢復(fù)至基線(xiàn)水平。同樣，10μM PD98059預(yù)處理SGC7901細(xì)胞1h阻斷MAPK/ERK的活性后，再加入200μg/ml的exosomes繼續(xù)作用72h，能逆轉(zhuǎn)exosomes誘導(dǎo)的ERK1/2的活化。相應(yīng)的MTT結(jié)果顯示LY

10、294002和PD98059能部分逆轉(zhuǎn)exosomes的促增殖作用。 4、200μg/ml的exosomes作用于SGC7901細(xì)胞24、48和72h，Western blot結(jié)果顯示，exosomes能下調(diào)Cbl—b和c—Cbl的表達(dá)，24h時(shí)兩者的表達(dá)水平輕度下調(diào)(分別是對(duì)照組的0.78和0.85倍)，72h時(shí)下調(diào)最明顯(分別是對(duì)照組的0.35和0.09倍)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)exosomes下調(diào)Cbl—b和c—Cbl的表達(dá)存

11、在劑量依賴(lài)性。 5、不同濃度的exosomes作用于Jurkat T細(xì)胞(3×105/ml)24、48和72h。臺(tái)盼藍(lán)拒染法顯示exosomes以時(shí)間和劑量依賴(lài)性的方式抑制Jurkat T細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀分析顯示不同濃度的exosomes作用于Jurkat T細(xì)胞48h后，exosomes能誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡。400μg/ml的exosomes作用于Jurkat T細(xì)胞48h后，有31.76％的細(xì)胞發(fā)生了凋亡，而對(duì)

12、照組僅有2.47％的細(xì)胞發(fā)生凋亡(p<0.01)。同時(shí)瑞氏—姬姆薩染色可見(jiàn)典型的凋亡形態(tài)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞膜完整，細(xì)胞質(zhì)固縮，胞核固縮或碎裂，可見(jiàn)凋亡小體。400μg/ml的exosomes分別作用于Jurkat T細(xì)胞24和48h，Western blot結(jié)果顯示exosomes作用24h能檢測(cè)裂解的Caspase—3、Caspase—8和Caspase—9片段，48h時(shí)更明顯。 6、400μg/ml的exosomes分別作用于

13、Jurkat T細(xì)胞24和48h，Western blot結(jié)果顯示，exosomes能上調(diào)Cbl—b和c—Cbl的表達(dá)，24h時(shí)兩者的表達(dá)水平輕度上調(diào)(分別是對(duì)照組的1.10和1.23倍)，48 h時(shí)明顯上調(diào)(分別是對(duì)照組的2.04和1.86倍)。進(jìn)一步檢測(cè)Cbl蛋白的下游分子Akt，發(fā)現(xiàn)exosomes以時(shí)間依賴(lài)性的方式下調(diào)p—Akt的表達(dá)，且p—Akt表達(dá)的下調(diào)與Cbl蛋白表達(dá)的上調(diào)同時(shí)發(fā)生。用蛋白酶體和Cbl蛋白的功能性抑制劑PS

14、—341抑制Cbl泛素連接酶的功能。結(jié)果顯示，10 nM PS—341預(yù)處理Jurkat T細(xì)胞4h，然后加入終濃度為400μg/ml的exosomes，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后細(xì)胞凋亡較單純exosomes組明顯減少，同時(shí)Western blot結(jié)果顯示PS—341部分逆轉(zhuǎn)了exosomes下調(diào)p—Akt表達(dá)的作用。 結(jié)論： 1、離心超濾和蔗糖密度梯度離心純化exosomes方法可行。胃癌SGC7901細(xì)胞來(lái)源的exosom

15、es為直徑在30-100 nm之間的囊性小泡，表達(dá)HLA—A、CD9和TSG101分子。 2、胃癌SGC7901細(xì)胞分泌的exosomes能以時(shí)間和劑量依賴(lài)性的方式促進(jìn)SGC7901和BGC823細(xì)胞增殖 3、Exosomes在促進(jìn)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖過(guò)程中上調(diào)了p—Akt和p—ERK的表達(dá)。抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK通路的活性可部分逆轉(zhuǎn)exosomes促進(jìn)SGC7901細(xì)胞增殖的作用。提示激活PI3K

16、/Akt和MAPK/ERK通路是exosomes促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。 4、Exosomes在促進(jìn)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖過(guò)程中下調(diào)了Cbl—b和c—Cbl的表達(dá)。 5、胃癌SGC7901細(xì)胞來(lái)源的exosomes能抑制Jurkat T細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡，在凋亡過(guò)程中伴有Caspase—3、Caspase—8和Caspase—9的活化。 6、胃癌SGC7901細(xì)胞來(lái)源的exosom