藤梨根干預(yù)胃癌細(xì)胞SGC7901-cDDP polβ的研究.pdf

1、　　胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)2000年資料統(tǒng)計(jì),全球每年新發(fā)胃癌87.6萬(wàn)例,占所有新發(fā)癌癥病例的9%,僅次于肺癌、乳腺癌和腸癌之后,位居第4位。每年約有64.7萬(wàn)人因胃癌死亡,位居癌癥死因的第2位[1]?，F(xiàn)階段胃癌的治療仍是以綜合治療為主,當(dāng)然手術(shù)是主要治療手段,由于許多胃癌發(fā)現(xiàn)就屬于中晚期,失去了手術(shù)機(jī)會(huì),化療是提高治愈的主要手段,多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)是化療失敗的主要因素,近年來

2、國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究已經(jīng)有了初步進(jìn)展,尋找耐藥逆轉(zhuǎn)劑是另外一種方向,越來越多的研究表明由于DNA聚合酶β在許多惡性腫瘤中均有較高表達(dá),同時(shí)也可以提高DNA修復(fù)能力。國(guó)內(nèi)外專家研究了許多新的抗癌藥物來防止耐藥的發(fā)生,那么另外的方法則是尋找耐藥逆轉(zhuǎn)劑來逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)許多西藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑進(jìn)行了許多研究,但是由于西藥的逆轉(zhuǎn)劑毒副作用大、作用靶點(diǎn)相對(duì)比較單一并且價(jià)格昂貴,在臨床上的應(yīng)用受到很大限制。中藥逆轉(zhuǎn)劑已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(diǎn),其主要優(yōu)勢(shì)

3、為副作用低、作用靶點(diǎn)較多等。
　　目的：通過臨床上的觀察、導(dǎo)師高萍教授的臨床經(jīng)驗(yàn)以及現(xiàn)代藥理學(xué)對(duì)藤梨根的認(rèn)識(shí),發(fā)現(xiàn)其具有抗癌作用,對(duì)胃癌、食管癌、結(jié)腸癌等腫瘤療效較好,所以藤梨根體內(nèi)體外研究受到了較多的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以胃癌SGC7901/cDDP細(xì)胞系為研究對(duì)象,運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞形態(tài)學(xué),MTT法等現(xiàn)代技術(shù)作為實(shí)驗(yàn)方法,同時(shí)應(yīng)用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)來分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過體外實(shí)驗(yàn)觀察一定劑量的RAE能否降低耐藥細(xì)胞株polβ基因的表達(dá)水平,以

4、至于此劑量的RAE可以逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥的作用。進(jìn)而為下一步臨床以及科研提供科學(xué)依據(jù),以期藤梨根可以成為中藥逆轉(zhuǎn)劑進(jìn)而應(yīng)用于臨床。
　　方法：①將胃癌細(xì)胞株SGC7901置于含 DDP(0.5μg/mL)的 RPMI-1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；用 MTT 法檢測(cè)藤梨根提取物( RAE)無明顯細(xì)胞毒劑量,并用無細(xì)胞毒性的劑量進(jìn)行逆轉(zhuǎn)耐藥試驗(yàn)；用 MTT法分別檢測(cè) SGC7901/cDDP加入藤梨根提取物與不加藤梨根提取物分別進(jìn)行

5、體外培養(yǎng) 48h 后細(xì)胞的殺傷活性以及存活率,將加 RAE 與不加 RAE 所得兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸的統(tǒng)計(jì)方法分別計(jì)算出各組的抑制一半時(shí)抑制劑的濃度也就是 IC50,計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=對(duì)照組IC50/實(shí)驗(yàn)組 IC50。②將耐藥細(xì)胞株同時(shí)分為兩組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組選用藤梨根提取物干預(yù),兩組細(xì)胞都需要應(yīng)用 RT-PCR 法檢測(cè) DNA 聚合酶β的表達(dá)水平。通過表達(dá)水平的高低變化來觀察藤梨根提取物是不是可以逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞株的耐藥③全部數(shù)據(jù)均

6、用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包處理,數(shù)據(jù)以x ±S 表示,IC50的計(jì)算采用線性回歸的統(tǒng)計(jì)方法,兩組數(shù)據(jù)比較,應(yīng)用 t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：①RAE對(duì)人胃SGC7901/cDDP細(xì)胞存在細(xì)胞毒性作用,并且同RAE的濃度有關(guān)。5、10、15μg/mL組與對(duì)照組抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),選用RAE100μg/mL其抑制率為19.3%,RAE1mg/mL抑制率為31.0%,與對(duì)照組比較有顯著意義(P<0.05)。所以根據(jù)統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)分析濃度為10μg/mLRAE抑制作用呈現(xiàn)濃度的依賴性即該濃度是最佳的逆轉(zhuǎn)劑的實(shí)驗(yàn)濃度。②單獨(dú)應(yīng)用順鉑,順鉑對(duì) SGC7901/cDDP細(xì)胞的 IC50 為 42.42μg/mL,順鉑與 10μg/ml 的非細(xì)胞毒性劑量 RAE 共同作用,其對(duì)SGC7901/cDDP的IC50降低為25.27 μg/mL,其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.68。③分別應(yīng)用 RT-PCR 法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組兩組細(xì)胞 polβ的表達(dá),對(duì)照組的 90%polβ基因呈高水

8、平表達(dá),只有 10%呈低水平表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組中有 20%polβ基因呈高水平表達(dá),其余80%呈低水平表達(dá)。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件系統(tǒng)分析后顯示polβ基因在兩組表達(dá)程度上差異性顯著,表明藤梨根提取物可以降低胃癌細(xì)胞株polβ基因的表達(dá)水平,從而逆轉(zhuǎn)耐藥。(P<0.05)。
　　結(jié)論：①RAE 對(duì) SGC7901/cDDP 細(xì)胞存在細(xì)胞毒性作用,但是其細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為對(duì) RAE 劑量的依賴性。②順鉑單獨(dú)作用于 SGC7901/cDDP 的

9、 IC50為 42.42μg/mL,順鉑與非細(xì)胞毒性劑 10μg/mL 的 RAE 共同作用, DDP 對(duì)SGC7901/cDDP的 IC50 降低 25.27μg/mL,是親本細(xì)胞 SGC7901為 1.68 倍。表明一定濃度的 RAE 對(duì)人胃癌 SGC7901 細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥可以起到部分逆轉(zhuǎn)的作用。③RT-PCR法分別檢測(cè)兩組細(xì)胞 polβ的表達(dá),對(duì)照組顯示 polβ基因的表達(dá)明顯增高,說明一定劑量的 RAE 能夠降低 SGC79