郁金香花色苷合成基因的克隆及其表達(dá)差異與花色變化的關(guān)系.pdf

1、郁金香（Tulipa L.）為百合科郁金香屬球根花卉，在園藝產(chǎn)業(yè)中占重要地位?；ㄉ菦Q定郁金香觀賞價(jià)值的重要因素?；ㄉ諡橛艚鹣慊ò甑闹饕?，獲取花色苷合成相關(guān)基因的信息對郁金香花色分子育種具有重要意義。郁金香品種Tulipa fosteriana‘Albert heijn’（花瓣粉色）經(jīng)多年芽變選育，獲得新品種‘上農(nóng)早霞’（花瓣紅色）和突變株系‘上農(nóng)09’（花瓣淺紅），花色為三者主要表型差異，然而，花色變化的生化和分子基礎(chǔ)尚不清楚。

2、本文首次從郁金香花瓣中克隆了花色苷合成相關(guān)的9個(gè)結(jié)構(gòu)基因和6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的cDNA全長，并從總花色苷和黃酮醇含量、花色苷組分、花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控等方面，對‘Albert heijn’、‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’進(jìn)行了分析比較，探討這些因素與‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’花色變化的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　1.‘Albert heijn’、‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’在花色、花瓣總花色苷和黃酮醇類物質(zhì)含量，以及花色苷組分方面

3、存在顯著差異。利用英國皇家園藝學(xué)會比色卡（RHSCC）對花色進(jìn)行描述，結(jié)果顯示，‘Albert heijn’花色屬于“Red-purple”（紅紫）色系，‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’花色分別屬于“Red”（紅）和“Orange-red”（橙紅）色系。應(yīng)用超高效液相色譜–二極管陣列器（ULPC-PDA）分析花瓣中總花色苷和黃酮醇類物質(zhì)的含量，結(jié)果顯示，花朵完全開放時(shí)，‘上農(nóng)早霞’花瓣總花色苷含量顯著高于‘Albert heijn’，但‘上農(nóng)

4、09’花瓣總花色苷含量與‘Albert heijn’無顯著差異，‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’總黃酮醇類物質(zhì)含量顯著高于‘Albert heijn’中相應(yīng)含量。應(yīng)用超高效液相色譜–四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-Q-TOF-MS）分析花瓣花色苷組分，結(jié)果表明，花朵完全開放時(shí)，‘Albert heijn’花瓣中含79.33％的矢車菊素3-O-蕓香糖苷和20.67%的天竺葵素3-O-蕓香糖苷，而‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’花瓣中含90%以上天

5、竺葵素花色苷（天竺葵素3-O-蕓香糖苷、天竺葵素3-O-乙?；|香糖苷）和少量矢車菊素3-O-葡萄糖苷含量（<10%）。
　　2.利用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)，首次從郁金香花瓣中克隆了9個(gè)花色苷合成結(jié)構(gòu)基因的cDNA全長，分別命名為 TfCHS1（1470 bp）、TfCHI1（998 bp）、TfCHI2（823 bp）、TfF3H1（1241 bp）、TfF3’H1（1766 bp）、TfDFR1（1394 bp）、TfANS

6、1（1371 bp）、Tf3GT1（1673 bp）和TfFLS1（1193 bp）。由這些基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其它物種中相應(yīng)蛋白具有很高的相似性，并具有相應(yīng)蛋白中保守的結(jié)構(gòu)域、氨基酸、結(jié)合位點(diǎn)及活性位點(diǎn)。
　　3.花色苷合成結(jié)構(gòu)基因在‘Albert heijn’、‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’花朵發(fā)育過程中的表達(dá)水平存在顯著差異。與‘Albert heijn’相比，‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’花瓣中TfCHS1、TfCHI2、TfF

7、3H1、TfDFR1、TfANS1、TfFLS1和TfF3’H1表達(dá)水平的變化與總花色苷和黃酮醇類物質(zhì)含量以及矢車菊素含量的變化正相關(guān)。在花朵發(fā)育過程中，TfCHS1、TfCHI2、TfF3H1、TfDFR1、TfANS1和Tf3GT1表達(dá)水平持續(xù)上升，與花色苷積累模式一致，TfFLS1表達(dá)量緩慢下降，與黃酮醇類物質(zhì)的積累模式一致。‘上農(nóng)早霞’花瓣中TfCHS1、TfCHI2、TfF3H1、TfDFR1、TfANS1和TfFLS1表達(dá)量

8、均顯著高于‘Albert heijn’，與‘上農(nóng)早霞’花瓣中更高的總花色苷和黃酮醇類物質(zhì)含量相對應(yīng)；‘上農(nóng)09’花瓣中TfCHS1、TfCHI2、TfF3H1和TfFLS1的表達(dá)水平顯著高于‘Albert heijn’，但TfDFR1和TfANS1表達(dá)水平與‘Albert heijn’無顯著差異，與‘上農(nóng)09’花瓣中更高的總黃酮醇類物質(zhì)含量相對應(yīng)?！限r(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’花瓣中TfF3’H1的表達(dá)水平顯著低于‘Albert heijn

9、’，與兩者花瓣中極低的矢車菊素含量相對應(yīng)。
　　4.分析了‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’TfF3’H1基因表達(dá)受抑制的原因。比較‘Albert heijn’、‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’TfF3’H1基因啟動子序列，發(fā)現(xiàn)與‘Albert heijn’相比，‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’TfF3’H1翻譯起始位點(diǎn)上游326 bp處插入了一段255 bp的序列。將郁金香三種材料TfF3’H1基因啟動子序列與GUS基因相連，轉(zhuǎn)化煙草葉片和擬南芥，

10、發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中，‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’TfF3’H1基因啟動子活性僅分別為‘Albert heijn’的5.4%和4.5%，表明TfF3’H1基因啟動子的插入突變顯著抵制了TfF3’H1的表達(dá)水平。
　　5.利用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)，同時(shí)基于郁金香花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，首次從郁金香花瓣中克隆了4條R2R3MYB和2條bHLH轉(zhuǎn)錄因子的cDNA全長，分別命名為TfMYB1（856 bp）、TfMYB2（840 bp）、T

11、fMYB3（906 bp）、TfMYB4（851 bp）、TfbHLH1（2527 bp）和TfbHLH2（2321 bp），TfMYBs與擬南芥PAP1和PAP2以及矮牽牛PhAN2有很高的同源性，TfbHLH1和TfbHLH2與擬南芥 AtEGL3、AtTT8、AtGL3以及矮牽牛PhAN1有很高的同源性。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了花朵發(fā)育過程中這些基因在‘Albert heijn’、‘上農(nóng)早霞’和‘上農(nóng)09’花瓣中的表達(dá)模式

12、，結(jié)果顯示，TfMYB2、TfMYB3、TfMYB4、TfbHLH1在花朵發(fā)育過程中的表達(dá)模式與 TfCHS1、TfCHI2、TfF3H1、TfDFR1、TfANS1和Tf3GT1的時(shí)空表達(dá)模式，以及花色苷的積累模式一致，此外，TfMYB2、TfMYB3和TfbHLH1在三種材料花瓣中的表達(dá)差異與 TfDFR1、TfANS1和Tf3GT1在三種材料中的表達(dá)差異一致，而TfMYB4與TfCHS1、TfCHI2和TfF3H1在三種材料中的表

13、達(dá)差異一致，表明 TfMYB2、TfMYB3和TfbHLH1可能參與了花瓣中TfDFR1、TfANS1和Tf3GT1的表達(dá)調(diào)控而TfMYB4可能參與了花瓣中TfCHS1、TfCHI2和TfF3H1的表達(dá)調(diào)控。
　　6. CHS和ANS分別為花色苷生物合成途徑上、下游關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控作用，分析了TfMYB2、TfMYB3、TfMYB4、TfbHLH1對基因 TfCHS1和TfANS1啟動子的調(diào)控作用。將

14、TfMYB2、TfMYB3、TfMYB4和TfbHLH1編碼序列與35S啟動子相連，將TfCHS1和TfANS1啟動子與LUC報(bào)告基因相連，共同轉(zhuǎn)化煙草葉片，通過測定煙草葉片中LUC基因的表達(dá)活性，檢測轉(zhuǎn)錄因子對啟動子活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TfMYB2和TfMYB3單獨(dú)或與TfbHLH1共同作用能顯著增強(qiáng)TfANS1啟動子活性，TfMYB4單獨(dú)或與TfbHLH1共同作用能顯著增強(qiáng)TfCHS1啟動子活性。這個(gè)結(jié)果表明，TfCHS1和TfA